[发明专利]一种人类肝纤维化、肝癌风险基因TNF-α多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类肝纤维化、肝癌风险基因TNF‑α多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒包括用于扩增与肝纤维化、肝癌发病风险相关的风险基因TNF‑αCR多态性的检测试剂、阳性对照品及阴性对照品组成，所述检测试剂包含用于扩增TNF‑α基因的rs1800629位点的引物序列、PNA序列和PCR反应液。本发明所述试剂盒用于检测人类肝纤维化、肝癌风险基因TNF‑α多态性具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，且能在1小时内完成检测，并且结果判读简单客观。

技术领域

本发明属于生物医学临床检测技术领域，具体涉及一种人类肝纤维化、肝癌风险基因TNF-α多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

肝纤维化是指肝细胞受到炎症刺激或发生坏死时，细胞外基质的增生与降解失去平衡，进而导致肝内结缔组织异常沉积的病理过程。原发性肝癌居常见恶性肿瘤的第五位，每年约超过60万人死于肝癌，在全球肿瘤相关性死亡中排名第三，我国患肝癌病例占全球的50％以上，对于肝癌的及时诊断和治疗对于提高患者生存率具有重要意义。

肝纤维化过程涉及多种细胞和细胞因子，形成一个复杂的网络系统调控肝纤维化的发生和发展。促纤维化因子TNF-α被认为是炎症相关性肿瘤中最重要的细胞因子，多项研究证明其参与肝损伤、肝纤维化及肝癌病理的发生发展过程。研究表明TNF-α基因启动子SNP(包括-1031、-863、-857、-376、-308、-238)可影响TNF-α的表达。大多研究表明TNF-α-308(G>A)与肝癌遗传易感性有关，具有临床检测意义，当-308位点G被A替换后，TNF-α的转录效率会增加6～7倍，使TNF-α的表达量显著上升。TNF-α-308(G>A)的SNP编号为rs1800629，位于TNF-α的启动子区域。NCBI各个文献中关于rs1800629等位基因人口多样性中统计数据显示亚洲人A等位基因基因型占比2.2～14.6％。文献表明广西壮族人群中正常对照组中A等位基因占比6.16％，而HCC患者占比17.16％，携带TNF-α-308A等位基因的个体患HCC的风险是携带G等位基因个体的3.153倍。该高频SNP的检测对于原发性肝癌的检测有重要价值。

目前针对SNP检测的常用方法有很多种，包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、PCR-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性PCR法、PCR-限制性片段长度多态性方法、荧光定量PCR法、巢式PCR-探针法、原位杂交(ISH)等。最为常见的方法是测序法，该方法费用低，但耗时长、灵敏度不高；高分辨率熔解曲线法对设备要求比较高，不利于临床推广；传统的荧光PCR法在临床上应用较为广泛，但检测微量灵敏度不高。因此，我们建立一种操作方便、成本不高、较高灵敏度的荧光PCR法检测肝纤维化、肝癌风险基因的多态性。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类肝纤维化、肝癌风险基因TNF-α多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于人类肝纤维化、肝癌风险基因TNF-α多态性检测的引物及PNA组，所述引物及PNA组包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.4所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.5所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA。