[发明专利]一种人类肝纤维化、肝癌风险基因TNF-α多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

权利要求书

1.引物及PNA组，其特征在于，所述引物及PNA组包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.4所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ IDNO.5所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ IDNO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA。

2.一种检测试剂盒，其特征在于，包括检测试剂、阳性对照品和阴性对照品；

所述检测试剂包含：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.3所示且5’端携带VIC荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ IDNO.4所示且5’端携带FAM荧光基团的鉴定引物、序列如SEQ ID NO.5所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.6所示且3’端携带BHQ淬灭基团的PNA、序列如SEQ ID NO.7所示的内参正向引物、序列如SEQ ID NO.8所示的内参反向引物、序列如SEQ ID NO.9所示且5’端携带ROX荧光基团的内参鉴定引物、序列如SEQ ID NO.10所示且3’端携带BHQ淬灭基团的内参PNA、以及PCR反应液；

所述阳性对照品包含：含TNF-α基因rs1800629-G、TNF-α基因rs1800629-A的重组质粒和含内参基因的重组质粒的混合物；

所述阴性对照为不含内参基因和目的基因位点的重组质粒。

3.根据权利要求2所示的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂中，序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所述引物的浓度为100~400nM，序列如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.9所述引物的浓度为50~100 nM，序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10所述PNA的浓度为50~100 nM。

4.根据权利要求2所示的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括Premix qPCRMIX以及TE缓冲液。

5.根据权利要求2所示的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为PUC-19质粒空载

体。

6.权利要求2~5任一项所述检测试剂盒在制备用于检测人类肝纤维化、肝癌风险基因TNF-α多态性产品中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，具体的检测方法包括如下步骤：

（1）采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血的基因组DNA作为待检测样本；

（2）荧光定量检测：向反应管中加入待检测样本和检测试剂，同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM、VIC和ROX荧光信号；

（3）PCR扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（1）中将所述待检测样本DNA稀释到浓度为0.1~100ng/μL，再进行PCR扩增反应。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃ 5秒，61℃ 32秒，不收集荧光；30个循环：95℃ 5秒，61℃ 32秒，采集荧光。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述结果判定的准则为：①当阳性对照组均有FAM、VIC、ROX荧光信号起线，阴性对照组均无FAM、VIC、ROX荧光起线，检测样本有ROX荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；② 根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断TNF-α基因rs1800629的分型：VIC荧光信号起线，TNF-α基因rs1800629分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，TNF-α基因rs1800629分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，TNF-α基因rs1800629分型为杂合突变型。