[发明专利]一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法

说明书

本发明公开了一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法，带有部分CGMMV序列的T1和带有Mg²⁺‑依赖的DNAzyme的部分酶序列的P1杂交，AcⅡ识别其底物序列5′‑AACGTT‑3′，后者被剪切成两部分，随后解链为4个ssDNA片段，加入脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)及dCTP，进行加尾反应，生成Mg²⁺‑依赖的DNAzyme的完整酶序列。然后再加入HP，HP的环部位与Mg²⁺‑依赖的DNAzyme的酶序列进行杂交，在Mg²⁺存在下，Mg²⁺‑依赖的DNAzyme酶序列剪切其识别位点，将HP的茎环结构剪切为两部分，位于茎部位的G‑四连体结构被释放，在K⁺存在下，结合Hemin形成Hemin/G‑四连体结构，在H₂O₂存在下，催化ABTS^2‑氧化，使溶液变绿。溶液吸光度与CGMMV浓度呈正相关。

技术领域

本发明属于光学生物传感技术领域，具体涉及一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法。

背景技术

黄瓜绿斑驳病毒(CGMMV)是一种侵染葫芦科作物的烟草花叶病毒属病毒，受侵染的瓜类作物在生长点周围表现出绿色斑驳等症状，CGMMV可以通过机械或通过种子传播，导致黄瓜，甜瓜和西瓜等经济作物的严重减产。由于葫芦科种子在国际贸易流通较大，因此CGMMV的传播风险很高。此外，西瓜碎片中的CGMMV在土壤中能存活10个月，表明被该病毒污染的土壤很难补救。严格的入境检测是防止这种检疫病原体进口的有效手段。因此，迫切需要快速、廉价、灵敏、特异的检测方法来检测CGMMV。

传统的病毒检测方法有血清学检测、电镜、聚合酶链反应(PCR)和电化学检测等。然而，这些方法有一些固有的缺点，血清学检测由于其操作简单且能同时处理大量样品而被广泛采用，但需要购买价格昂贵的血清学检测试剂盒，并且检测结果的准确性取决于抗体的质量。电镜检测则需的大型和笨重的仪器，费力，不敏感，而且耗时。

可视化检测因其简单、灵敏度高、直观等优点而受到人们的广泛关注。与病毒相关的比色检测已被报道，包括禽流感、H5N1流感病毒、乙型肝炎病毒、寨卡病毒和裂谷热病毒，但是对于植物病毒的可视化检测报道较少。

发明内容

针对以上存在的技术问题，本发明提供一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法。

本发明的技术方案为：一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法，包括以下步骤：

(1)将T1和P1混合在NEB CutSmart缓冲溶液中，在37℃下杂交；

(1)(2)加入内切酶AcⅡ，利用AcⅡ识别5′-AACGTT-3′位点，在37℃下持续反应一定时间，获得酶切产物，37℃下解链为4个ssDNA片段；

(3)取一定量的所述酶切产物，加入TdT、dCTP于磷酸盐缓冲溶液中混合，在37℃反应温度条件下进行加尾反应，升温至85℃灭活3min，获得Mg²⁺-依赖的DNAzyme的完整酶序列；

(4)加入HP和含Mg²⁺缓冲液，在37℃下孵育100min，Mg²⁺-依赖的DNAzyme的完整酶序列与HP进行杂交，在Mg²⁺存在下，Mg²⁺-依赖的DNAzyme剪切HP的识别位点，将HP剪切为两部分；

(5)加入一定浓度的Hemin和含K⁺缓冲液，在37℃下孵育30min，形成Hemin/G-四连体结构溶液；