[发明专利]一种基于TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法

权利要求书

1.一种基于脱氧核苷酸末端转移酶TdT和DNAzyme扩增的黄瓜绿斑驳病毒可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将T1和P1混合在NEB CutSmart缓冲溶液中，在37℃下杂交；

(2)加入内切酶AcⅡ，利用AcⅡ识别5′-AACGTT-3′位点，在37℃下持续反应一定时间，获得酶切产物，37℃下解链为4个ssDNA片段；

(3)取一定量的所述酶切产物，加入TdT和dCTP于磷酸盐缓冲溶液中混合，在37℃下进行加尾反应，升温至85℃灭活3min，获得Mg²⁺-依赖的DNAzyme的完整酶序列；

(4)加入HP和含Mg²⁺缓冲液，在37℃下孵育100min，Mg²⁺-依赖的DNAzyme的完整酶序列与HP进行杂交，在Mg²⁺存在下，Mg²⁺-依赖的DNAzyme剪切HP的识别位点，将HP剪切为两部分；

(5)加入一定浓度的Hemin和含K⁺缓冲液，在37℃下孵育30min，形成Hemin/G-四连体结构溶液；

(6)最后依次在Hemin/G-四连体结构溶液中加入一定浓度的ABTS^2-和H₂O₂溶液，室温下反应一段时间，得到绿色溶液；

所述T1的基因序列如SEQ ID No.1所示，P1的基因序列如SEQ ID No.2所示，HP的基因序列如SEQ ID No.3所示，SEQ ID No.1：AACCCGAACGTTTG，SEQ ID No.2：ACACACAGCGATCACCCATGTTAAACGTTCGGGTT，SEQ ID No.3：TTTTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTATrAGGTGTGTATCCCGCCC；

步骤(1)中所述P1浓度为1.0μM；

步骤(4)中所述HP浓度为1.0μM；

步骤(2)中所述AcⅡ的酶切反应时间为50min；

步骤(3)中所述加尾反应时间为30min；

步骤(4)中所述Mg²⁺-依赖的DNAzyme和HP的杂交时间为100min。