[发明专利]木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌株及其构建方法，该菌株的基因组上整合了多拷贝的阿拉伯糖代谢基因表达盒，所述基因表达盒包含基因araA、araB、araD、GAL2和STP2。本发明的的酿酒酵母菌能够用于代谢木质纤维素原料中的木糖和阿拉伯糖而生成乙醇。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种木糖阿拉伯糖共利用的酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术

生物乙醇作为一种重要的商业化绿色可再生运输燃料，在美国、巴西以及国内等地已开始部分替代汽油使用。一代燃料乙醇是以淀粉基(如玉米、木薯)或糖基(如甘蔗、甜菜)为原料制得，虽然是目前燃料乙醇的主要获得方式，但是存在“与人争粮、与粮争地、与畜争料、与农争利”的问题，同时在降低温室气体排放方面优势不大。二代燃料乙醇以玉米秸秆、小麦秸秆、稻草等非粮作物为原料，不存在“与人争粮、与粮争地”等问题，温室气体排放也较一代玉米原料乙醇下降67％，因上述优点，成为目前燃料乙醇的发展方向。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可在厌氧条件下快速代谢葡萄糖高得率生产乙醇，同时可耐受低pH环境，适应高密度发酵，对预处理环节产生的各种抑制物成分也有不错的基础耐受能力。此外遗传背景清晰，各种分子工具齐全，便于进行遗传改造，是燃料乙醇生产的优良宿主。虽然酿酒酵母能够利用葡萄糖，但天然无法代谢存在于木质纤维素原料中的木糖和阿拉伯糖这样的戊糖成分。所以开发戊糖酵母便成为提高二代燃料乙醇生产经济性的关键。

阿拉伯糖是木质纤维素水解液中含量仅次于木糖的戊糖成分，自然界中存在两种典型的阿拉伯糖代谢途径，即细菌中的异构化途径和真菌中的氧化还原途径。异构化途径相比于氧化还原途径，所需步骤少，反应相对简单。阿拉伯糖经转运蛋白转运进入细胞内后，在阿拉伯糖异构酶(araA基因编码)作用下转变为L-核酮糖，L-核酮糖经L-核酮糖激酶(araB基因编码)磷酸化后生成5-磷酸-L-核酮糖，进而在araD基因编码的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶作用下生成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖途径最终转变为乙醇。2001年Nancy W.Y.Ho实验室(Sedlak,M.and N.W.Ho.Enzyme Microb Technol,2001.28(1):p.16-24.)首次在酿酒酵母中引入大肠杆菌(Escherichia coli)来源的阿拉伯糖异构化途径基因araA、araB和araD，但是未能将阿拉伯糖转化为乙醇。基于同样的异构化路线，随后Eckhard Boles实验室(Becker,J.and E.Boles.Appl Environ Microbiol,2003.69(7):p.4144-4150.)使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的araA替换大肠杆菌来源，同时过表达酵母内源的糖转运蛋白基因GAL2，可是重组菌株依然无法利用阿拉伯糖生长。该实验室随后在此基础上又尝试了不同细菌来源的araA基因，发现地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)来源的效果较好，同时对其和大肠杆菌来源的araB、araD基因进行密码子优化，获得的菌株150h消耗30g/l阿拉伯糖(Wiedemann,B.and E.Boles.Appl EnvironMicrobiol,2008.74(7):p.2043-50.)，暗示途径基因的有效表达可能是瓶颈。最近研究人员基于植物乳杆菌来源的araABD基因序列在数据库搜索同源序列以寻找新的基因来源，发现戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)来源的araABD与之有较高相似度，将之导入酿酒酵母后依然无法利用阿拉伯糖(Caballero,A.and J.L.Ramos.Microbiology,2017.163(4):p.442.)。显然直接在酿酒酵母导入异构化途径无法实现菌株高效代谢阿拉伯糖。