[发明专利]野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途

说明书

本发明提供了一种野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途，本发明的野生型特异性阻止探针结合多重PCR方法可以在存在大量野生型DNA情况下富集肿瘤驱动突变基因，能够一次性扩增多个驱动肿瘤突变基因，并且具有很低的检测阈值，具有高精确性、高敏感性、成本低、无创、省时、高通量和操作简便等优点，可用于临床高危人群的预警筛查，肿瘤病人的预测、判断预后及药物靶向治疗，直接可以应用到临床。

技术领域

本发明属于医学检测领域，具体涉及一种野生型特异性阻止探针、检测方法及其用途。

背景技术

基于人类基因组计划，一批人类疾病相关的基因被揭示，而这些人类疾病相关的基因被迅速应用于疾病的风险评估、预防、诊断和个体化治疗。近年来，随着新一代基因检测技术的发展和应用，更多的遗传病和恶性肿瘤的致病或易感基因得到检测，迄今为止，科学家已经发现了大约60个基因与临床用药及治疗效果有关。

肿瘤是世界人口死亡的一个主要原因，从2008-2030年，中国实际预计的肿瘤发病和死亡人数将持续增长。国际癌症研究中心(IARC)报告显示，2030年中国预计将有487万癌症新发病例，死亡病例达到360万，每年用于癌症患者的医疗费用近千亿元。传统的癌症治疗有手术、放化疗、介入治疗、免疫疗法等，据统计药物治疗在癌症患者人群中无效率高达75％，为了增加治疗的有效性，越来越多的靶向治疗用于治疗晚期癌症得的患者。临床实践证明靶向药物治疗比传统的化疗更有效。然而，由于肿瘤的异质性和肿瘤的克隆演变及自然选择的结果，几乎所有肿瘤对药物产生了耐药性。为了选择哪些病人能够从特定的药物治疗中受益或无效，靶向药物基因检测已成为不可缺少的工具。

在过去的10年中肿瘤靶向治疗已经取得了很大的进展。近年有人提出了驱动基因的概念，驱动基因是与肿瘤发生发展相关的重要基因，知道了肿瘤的驱动基因，便可以清楚哪些药物可以对抗它，而当驱动基因突变后，则原来可以对抗它的药物失去对其的敏感性。比如，检测KRAS基因突变可以判断药物维克替比治疗转移性大肠癌的治疗敏感性，而KRAS基因突变的病人用维克替比药物治疗是无效的。检测HER2基因可以指导乳腺癌病人用靶向药物赫赛丁的敏感性，若HER2蛋白或基因拷贝数增加，病人用赫赛丁是有效的。然而肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤游离DNA量非常少，而突变的驱动基因只占野生型DNA的0.1-1％，使得在大量野生型背景下检测低水平的肿瘤驱动突变基因存在技术上的挑战。为了富集基因组肿瘤驱动突变基因，几种优先富集驱动突变基因的技术已经被开发。相比全基因组测序，有针对性的测序覆盖的基因组区域的数量减少，并且可以显著增加肿瘤病人低水平的突变基因检测灵敏度。虽然几个基因检测方法已被应用，但上述的方法在检测驱动突变基因方面只能检测单一的突变基因，通量低，检测阀值高，扩增的突变基因产物无法进行高通量测序的缺陷。为此，本发明提供一种野生型特异性阻止探针以及检测方法以富集多个肿瘤驱动突变基因，检测阈值低，可以进行高通量测序，同时具有无创、简便、精确度及灵敏度均高等优点，可以直接用于临床肿瘤病人的筛查，诊断，判断药物的疗效及预后。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的检测突变基因技术存在只能检测单一的突变基因，通量低，检测阀值高，扩增的突变基因产物无法进行高通量测序等缺陷，从而提供一种野生型特异性阻止探针以及检测方法以富集多个肿瘤驱动突变基因，检测阈值低，可以进行高通量测序，同时具有无创、简便、检测阈值低、精确度及灵敏度均高等优点。

本发明提供了一种野生型特异性阻止探针，所述探针的结构包括：

1)与待测基因野生型等位基因特异互补结合；

2)3’末端修饰有延伸阻断物；

3)长度为15-25个核苷酸。

所述的野生型特异性阻止探针，所述3’末端修饰有C3 spacer或Dideoxy-Cytosine(ddC)。

本发明提供了基于抑制野生型的多重PCR扩增反应体系，包括所述的野生型特异性阻止探针。