[发明专利]一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体及其应用

说明书

本发明公开一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体及其应用，属于生物技术领域。本发明的重组载体可以敲除酿酒酵母基因组中的SED1基因，得到的突变菌株在裂解酶Zymolyase作用下能使细胞快速裂解，释放细胞内物质至胞外。操作对象为酿酒酵母，具有广泛适用性。裂解过程中无需添加额外试剂，成本廉价。裂解时间短，2h可将细胞完全裂解，大大缩短了以往酿酒酵母细胞裂解的时间。操作简便，不需玻璃珠等繁琐步骤和配制复杂裂解液，只需一种简单的缓冲液，大大简化了实验流程。因此，可利用本发明的酿酒酵母裂解方法进行酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和高通量筛选等，具有简易、快捷、廉价的优点，具有较广的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别提供一种构建酿酒酵母快速裂解工程菌的重组载体和供体DNA，以及通过其获得的酿酒酵母工程菌在酵母细胞内活性物质的提取、基因工程酵母表达系统表达产物的提取以及酵母细胞胞内表达重组蛋白(酶)快速检测的应用。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种广泛研究的单细胞真核微生物，具有复杂的细胞壁结构。酿酒酵母细胞壁厚度约100～300nm，类似“三明治”结构，主要由β-D-葡聚糖(β-D-glucan)、α-D-甘露聚糖(α-D-mannose)和少量的几丁质(chitin)组成。其中葡聚糖是最主要的结构成分，它与原生质体膜相连，起到维持细胞形态和正常渗透压的作用。甘露聚糖与蛋白质共价键相连形成甘露糖蛋白(mannoprotein)，甘露糖蛋白主要分布在细胞壁外层，可以过滤大分子物质。而几丁质只占细胞干重的1～2％，其还原端与β-1,3-葡聚糖支链的还原端以β-1,2键或β-1,4键的形式相连。

目前酿酒酵母破壁的方法有很多，根据作用细胞壁的结构部位不同，可分为破坏葡聚糖结构、破坏甘露糖结构、破坏蛋白质结构和破坏多处结构等。采用的方法包括酸碱破壁、微波破壁、超声波法破壁、单酶法和复合酶法等。虽然这些方法不断的改进，但仍存在操作繁琐、破壁效率低、时间较长和对仪器要求较高等问题。

酿酒酵母在生物研究领域应用越来越广泛，但现有的破壁方法严重限制了外源基因在酿酒酵母中的克隆、表达及活性鉴定，因此，建立简单快捷并可广泛推广的破壁方法、以有效实现酿酒酵母细胞来源的核酸、蛋白、酶、多肽等各种活性物质的提取制备以及基因工程酵母表达产物的活性鉴定和提取、生产尤为重要。