[发明专利]一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体及其应用

权利要求书

1.一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体，其特征在于所述重组载体包括自5ʹ到3ʹ顺次连接Cas9表达框和gSED1表达框；

所述的Cas9表达框核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1核苷酸序列；

所述的gSED1表达框核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2核苷酸序列；

用于构建所述重组载体的出发载体为任意一种酿酒酵母载体。

2.根据权利要求1所述的构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体，其特征在于：

用于构建所述重组载体的出发载体为p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t和p414-TEF1p-Cas9-CYC1t载体。

3.一种酿酒酵母裂解工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

将权利要求1～2任一项所述的重组载体和供体DNA同时转化到酿酒酵母感受态细胞中，实现基因组中SED1基因的敲除，获得酿酒酵母突变株，即酿酒酵母裂解工程菌。

4.根据权利要求3所述的酿酒酵母裂解工程菌的构建方法，其特征在于：

所述的供体DNA核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3核苷酸序列。

5.根据权利要求3或4所述的酿酒酵母裂解工程菌的构建方法，其特征在于：

所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741，酿酒酵母BJ5464或酿酒酵母CEN.PK2-1Ca。

6.一种酿酒酵母裂解工程菌，其特征在于：通过权利要求3～5任一项所述的构建方法构建得到。

7.一种酿酒酵母裂解方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将外源基因表达载体转化到权利要求6所述的酿酒酵母裂解工程菌中，得到重组突变菌株；

（2）培养重组突变菌株，加入裂解酶Zymolyase孵育，酿酒酵母细胞裂解，胞内物质释放到胞外；

（3）对释放到胞外的胞内物质进行酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和胞内蛋白高通量筛选。

8.根据权利要求7所述的酿酒酵母裂解方法，其特征在于：

所述裂解酶Zymolyase浓度为1～10 U/mL，孵育时间为1～6 h。

9.权利要求6所述的酿酒酵母裂解工程菌或权利要求7或8所述的酿酒酵母裂解方法在酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和胞内蛋白高通量筛选中的应用。