[发明专利]一种筛选促干细胞归巢药物的方法、重组载体和细胞株

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体为一种重组载体以及含有这种重组载体的稳转细胞株，可用于筛选促干细胞归巢药物。这种重组载体含有CXCR4启动子序列和luc2荧光素酶报告基因；且luc2荧光素酶报告基因位于CXCR4启动子序列下游。含有上述的重组载体以及内参荧光酶载体的稳转细胞株可以用于检测CXCR4基因的表达活性水平，进而用于高通量筛选促进干细胞归巢的药物。因此，上述稳转细胞株，加入候选药物进行刺激，通过luc2相对荧光强度，可评价该候选药物促进CXCR4启动子表达的活性，从而筛选干细胞归巢的药物或者筛选治疗或辅助治疗心肌梗死的药物，有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及能稳定表达CXCR4启动子基因的双荧光素酶报告细胞株的构建方法及其应用，更具体地说，本发明提供一种能用于筛选促干细胞归巢药物的稳转细胞株的构建方法，并用其筛选可能的药物单体，为高通量筛选促干细胞归巢药物提供了生物材料。

背景技术

心肌梗死(myocardial infarction,MI)导致的进行性心力衰竭依然是现代心脏病的巨大挑战。通过移植自体或异体间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)能增强心脏功能，缩小梗死面积，延缓心衰进程，在MI的治疗中具有广阔的应用前景。然而，移植后MSCs较低的心脏留存率严重限制了其治疗效果。研究显示，静脉注射后仅有2％的干细胞归巢至心脏，冠脉注射为15％,而直接注射到心肌内也仅有11％的留存率，大部分细胞分散在肺，肝和脾。因此促进移植后更多的干细胞向心肌梗死区归巢是增强MSCs治疗MI作用的关键。

CXC趋化因子受体4[chemokine(C-X-C motif)receptor 4,CXCR4]和其配体基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)在MSCs归巢中发挥主要作用。CXCR4是7次跨膜的G蛋白偶联受体，通过与SDF-1α特异性结合介导MSCs迁移、增殖和分化。研究发现，提高MSCs表达CXCR4水平能增强细胞迁移和向MI区域归巢的能力，而使用CXCR4阻断剂AMD3100能明显抑制干细胞归巢至心肌梗死区域，归巢细胞数量显著减少。因此，以CXCR4表达水平为考察对象，筛选能促进MSCs归巢的候选单体，对于增强MSCs的治疗作用具有十分重要的意义。据此，本发明构建了含CXCR4启动子的双荧光素酶报告系统的药物高通量筛选模型，并验证了该细胞模型的可靠性。

发明内容

本发明旨在提供一种重组载体以及含有这种重组载体的稳转细胞株，可用于筛选促干细胞归巢药物。

本发明还将这种重组载体和稳转细胞株用于筛选促干细胞归巢的药物或者筛选治疗或辅助治疗心肌梗死的药物。

本发明还提供了一种筛选促干细胞归巢的药物或者筛选治疗或辅助治疗心肌梗死的药物的方法。

本发明的技术方案为，一种重组载体，含有CXCR4启动子序列和luc2荧光素酶报告基因；所述的luc2荧光素酶报告基因位于CXCR4启动子序列下游。优选的，所述重组载体为含有CXCR4启动子序列和luc2荧光素酶报告基因的pGL4.17载体。

这种重组载体的构建方法为，在CXCR4启动子DNA的5’端和3’端分别引入不同的酶切位点，并将CXCR4启动子和荧光酶报告载体经酶切后连接。具体为，将CXCR4启动子基因插入荧光素酶报告载体pGL4.17，构建CXCR4启动子重组载体pGL4.17-CXCR4。优选的，所述重组载体的构建方法为，在CXCR4启动子DNA的5’端和3’端分别引入酶切位点XhoI和HindIII；将CXCR4启动子DNA序列和luc2荧光素酶报告载体pGL4.17分别用XhoI和HindIII双酶切，连接后用感受态细胞转化，通过酶切和测序双重鉴定后得到pGL4.17-CXCR4重组载体。用T4连接酶进行连接，感受态细胞为大肠杆菌DH5α。

一种稳转细胞株，含有上述的重组载体以及内参荧光酶载体。优选的，其宿主细胞为人胚肾上皮细胞293。