[发明专利]一种hsa-miR-146a-5p基因PCR检测试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种hsa‑miR‑146a‑5p基因PCR检测试剂盒及应用，所述试剂盒包含hsa‑miR‑146a‑5p基因反转录反应液、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应液、Taq酶、hsa‑miR‑146a‑5p基因特异性引物、探针、阳性质控品和阴性质控品；利用本发明提供的hsa‑miR‑146a‑5p最佳临界值判断白血病细胞株不耐药准确率可以达到80％以上，对于实验研究中耐药细胞株筛选提供极大的便利，本发明所用的试剂，包括酶、buffer、引物和探针等均经过仔细设计和优化，极大的提高了基因表达检测的准确性。

技术领域

本发明属于生命科学与生物技术领域，具体涉及白血病细胞耐药 相关基因hsa-miR-146a-5p的检测探针及相关检测试剂盒，具体涉及 一种hsa-miR-146a-5p基因的特异性探针制备引物、hsa-miR-146a-5p 基因表达量检测的快速检测试剂盒及用于白血病细胞株耐药性的快 速评估方法。

背景技术

白血病是世界范围内一种常见的血液系统恶性肿瘤疾病，但其病 因尚未完全明确。我国白血病发病率居各类肿瘤发病率的第6位，其 中急性髓细胞白血病(acutemyeloid leukemia，AML)和急性淋巴细胞 白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)发病率较高，慢性髓细胞 白血病(chronic myeloid leukemia，CML)，而慢性淋巴细胞白血病 (chronic lymphocyte leukemia，CLL)则在临床较为少见(急性白血病 与慢性白血病的发病率之比为5.5∶1)。虽然对白血病发病机制的研究 已经取得了长足进展，治疗效果明显提高，患者5年生存率也显著改 善，但仍有部分患者难以治愈，且复发比例非常高。

药物耐受是现阶段癌症治疗的最大挑战，而白血病难治、复发的 最主要原因就是白血病细胞的耐药性。对于大部分的白血病患者而言， 对化疗药物产生耐药性几乎是不可避免、而且也是致命性的。药物耐 受是指肿瘤细胞接触抗肿瘤药物后产生抗药性，也可能对不同结构、 不同机制的其他抗肿瘤药物产生交叉耐药，是临床上肿瘤药物治疗中 最常见的问题，也是最危险的原因。因此，探索白血病细胞的耐药机 制并加以有效逆转，已成为提高白血病患者长期生存的有效途径之一。

进入二十一世纪以来，白血病耐药基因筛查已经成为全世界白血 病研究、治疗领域的一大焦点，NCBI pubmed检索相应的文献累计超 过了3000篇，在100余个基因中发现了超过5000种突变可能与白血 病细胞耐药相关，但是其中的机制尚未完全明了，尤其是原代细胞株 很难在第一时间确定是否存在耐药风险。近年来，国内相继报道了白 血病耐药基因突变位点的基因诊断试剂盒或者相关基因表达的检测 方法，如北京大学人民医院2010年发表的“一种定量检测BCR/ABL mRNA水平的试剂盒”(CN101624621A)，苏州大学附属第一医院 2012年发表的“检测bcr/abl融合基因abl激酶区耐药突变位点的方 法及试剂盒”(CN102676638 A)等。此外，还有一系列文章探讨了 多药耐药基因(mdr1)，耐药蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)， 乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)，以及凋亡相 关蛋白(BCL-2，BCL-xl，BAX等)在白血病耐药、复发中的关系。 这些检测方法的开发极大的推动了白血病相关基础研究和临床药物 开发的进步，但单一检测方法的有效性和覆盖度还明显欠缺；利用基 因组测序、全外显子测序等方法可以实现整体覆盖，目前的成本还相 对较高。本发明首次利用hsa-miR-146a-5p基因表达作为白血病细胞 株耐药评估指标，设计了特异性探针，利用本发明方法能够快速、高 效地对耐药细胞株进行筛查。

发明内容

本发明目的是提供一种具有快速、高覆盖特点的hsa-miR-146a-5p 基因检测探针以及相关检测试剂盒，有利于实验室研究中白血病耐药 细胞株筛选的快速评估，以及临床白血病患者耐药风险评估。

本发明采用的技术方案是：