[发明专利]一种hsa-miR-146a-5p基因PCR检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种hsa-miR-146a-5p基因PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含hsa-miR-146a-5p基因反转录反应液、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq酶、PCR反应液、hsa-miR-146a-5p基因特异性引物和探针、阳性质控品和阴性质控品；

hsa-miR-146a-5p基因特异性上游引物：CCGATGTGTATCCTCAGCTTT；

hsa-miR-146a-5p基因特异性下游引物：ATCCCAGCTGAAGAACTGAA；

hsa-miR-146a-5p基因探针：AGGTCTGACACTGACACAACCCATGG；

所述阳性质控品为hsa-miR-146a-5p基因，阴性质控品为体积浓度0.1％DEPC水。

2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述hsa-miR-146a-5p基因反转录反应液组成为：10mM dNTP混合液、5×RT缓冲液、10mM的MgCl₂、lμM的hsa-miR-146a-5p特异性miRNA逆转录引物；所述5×RT缓冲液由250mM Tris-HCl、375mM KCl、15mM MgCl₂、50mM DTT组成；

hsa-miR-146a-5p特异性miRNA逆转录引物：

5'–GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA-3'。

3.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述PCR反应液组成：10mMdNTP混合液、25mMMgCl₂、无Mg²⁺10×Taq缓冲液、体积浓度0.1％DEPC水。

4.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒由hsa-miR-146a-5p基因反转录反应液、MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq酶、PCR反应液、hsa-miR-146a-5p基因特异性引物和探针、阳性质控品、阴性质控品和体积浓度0.1％DEPC水组成。

5.一种权利要求1所述hsa-miR-146a-5p基因PCR检测试剂盒在筛选白血病耐药细胞株中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用是以待测样品白血病细胞株RNA为模板，利用所述试剂盒进行反转录反应获得反转录产物，然后反转录产物进行荧光定量PCR反应；若质控品检测结果无法同时满足以下两个条件：(1)阳性质控品检测Ct值在30-33范围内且有明显指数增长期；(2)阴性质控品检测Ct值>45或无Ct值，则判定试剂盒失效，需重复检测，在试剂盒有效的情况下，当待测样品Ct值＜24，则存在耐药风险。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述逆转录反应方法为：取hsa-miR-146a-5p基因反转录反应液4μL，MMLV逆转录酶0.67μL，RNA酶抑制剂0.15μL，6ng/μL待测样本RNA 5μL，加0.1％DEPC水补足到15μL，进行PCR反应，获得待测样本反转录产物；同时以5μL阳性质控品和5μL阴性质控品代替待测样本进行PCR反应作为质控；所述PCR反应条件：16℃30min；42℃30min；85℃5min；4℃2min。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述荧光定量PCR反应方法为：取反转录产物2μL，PCR反应液16μL，10μM hsa-miR-146a-5p基因特异性上游引物1.2μL，10μM hsa-miR-146a-5p基因特异性下游引物1.2μL和10μM hsa-miR-146a-5p基因探针1.3μL，Taq酶0.3μL，用0.1％DEPC水补足至25μL，进行荧光定量PCR反应；所述荧光定量PCR反应条件为：95℃：2分钟预变性，95℃8s，60℃30s，40个循环。