[发明专利]一种极度濒危植物贵州大花杜鹃的组培繁殖及离体保存方法

说明书

本发明公开了一种极度濒危植物贵州大花杜鹃的组培繁殖及离体保存方法，该方法适用于杜鹃花科贵州大花杜鹃的组培快繁及离体保存，属植物生物技术领域。本发明以开花过后的新抽稍的嫩茎段为外植体，通过外植体消毒、丛生芽诱导、壮苗、离体保存、生根一系列步骤，有效解决了因贵州大花杜鹃分布区域窄、引种驯化难造成的植株量少，毗邻濒危的现状，达到物种保护的目的。本发明提供的组培快繁方法，在1个月内增殖系数为8‑10，生根率为95%，移栽成活率为95%‑98%，极大地提高了贵州大花杜鹃的繁殖系数，离体保存可达240d以上，为该物种的引种驯化、离体保存、种苗扩繁回归种植提供了技术支撑。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种极度濒危植物贵州大花杜鹃组培繁殖及离体保存方法。

背景技术

贵州大花杜鹃（Rhododendron magniflorum）是杜鹃花科常绿杜鹃亚属云锦杜鹃亚组物种，该物种发表于 1985 年，是杜鹃花属中具有最大花朵的杜鹃。在最新出版的杜鹃花红色名录《The Red List of Rhododendron》 中列为极度濒危物种。该种分布在贵州省安龙县龙头大山，单个花朵花冠直径达10cm左右，具有较高的观赏价值。在最新的调查中，该种目前仅找到一个居群，且仅存3株。因种群稀少，自然更新差，急需进行有效的组培繁殖及离体保存，避免物种走向灭绝。目前针对该种的组培繁殖及离体保存方法还未见报道。

发明内容

针对贵州大花杜鹃种群稀少，野外植株濒危这种现象，本发明旨在提供一种贵州大花杜鹃组培繁殖及离体保存方法，保存种质资源，保护濒危物种。

1.一种贵州大花杜鹃的组培繁殖及离体保存方法，其特征在于：

1）外植体选择：取贵州大花杜鹃的新嫩茎段，用自来水冲洗12h后备用；

2）外植体灭菌：取备好的外植体在无菌超净台上，用75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗3-5遍，用0.1%氯化汞消毒8-9min，使用无菌水冲洗3-5遍；

3）丛生芽诱导：丛芽诱导培养基为改良WPM +2.5mg/L 2-iP（2-异戊烯腺嘌呤）+0.8mg/L IBA，蔗糖28g/L，琼脂7g/L，pH5.6。改良WPM培养基为硝酸铵提高至为700mg/L，其他元素用量保持不变。将经过外植体灭菌过程后得到的茎段，在超净台上，用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌刀切割茎段，每段带一个潜伏芽，接种至丛生芽诱导培养基内，暗培养5天后进行光照培养30天以上, 培养35-50天，光暗时间为12h/12h，光照强度为1500-2000LUX；

4）壮苗培养：壮苗培养基为改良WPM +0.5mg/L 2-iP +0.1mg/L IBA，蔗糖28g/L，琼脂7g/L，pH5.6；将诱导出的新芽，接种至壮苗培养基内，将瓶苗处于光暗时间为12h/12h，光照强度为1500-2000LUX；

5）离体保存：离体保存培养基为改良WPM +0.5mg/L IBA+6mg/L CCC，pH5.6，蔗糖28g/L，琼脂6-7g/L，温度为13-18℃，光强度为1500LUX-1600LUX，光暗时间为10h/14h，培养基为260ml培养瓶灌装65ml培养基；恢复生长分化培养基为改良WPM+1mg/L 6-BA+0.05mg/LIAA，光暗时间为12h/12h，光照强度为1500-2000LUX；

6）生根培养：将生长至1.5cm~2cm高的芽苗转接至培养基为改良WPM +1mg/L IBA的培养基中，附加蔗糖28g/L，琼脂7g/L，pH5.6；光强度为2000LUX-2500 LUX，光暗时间为12h/12h；

除离体保存培养基使用260ml培养瓶需灌装65ml外，其余各培养基均使用260ml培养瓶灌装45ml培养基；培养温度除离体保存为13-18℃，其余均为20-23℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：