[发明专利]基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法。该引物包括检测引物Ft和Bt；其中，检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的试剂盒，该试剂盒包括上述引物，Bst DNA聚合酶，以及钙黄绿素和氯化锰的混合溶液等。利用上述引物或试剂盒能对单增李斯特菌进行聚合酶螺旋反应的检测，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，反应过程简便、检测周期短、特异性强、可用肉眼观察检测结果。本发明对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

李斯特菌是一种兼性厌氧细菌，主要存在于土壤，在土壤中以死亡和正在腐烂的有机物为食用。其中只有单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)是具有致病性，而单增李斯特菌是当中唯一一种人畜共患致病菌。单增李斯特菌广泛存在食品中，在肉类、家禽以及生鲜海鲜食品有非常高的检出率，而且它的平均致死率达到30％，远远超过其他普遍食源性致病菌，例如肠炎沙门氏菌(0.38％)、弯曲杆菌菌属(0.02％～0.1％)和霍乱弧菌(0.005％～0.01％)。目前，我国常规检测方法大多数要经过液体选择性培养基富集，固体选择性培养基分离，最后还要对菌株进行生化鉴定和血清学等过程。这些实验操作繁琐，耗时长，检出率低，大大降低了食品加工工厂、出入境检验检疫以及食品卫生监督效率，同时也影响生鲜食品的感官性状，对整个食品行业都造成了很大的损失。因此，建立单增李斯特菌快速、准确、特体、灵敏度的检测诊断方法是十分必要的。

目前对单增李斯特菌的检测方法除了传统的生化鉴定方法，还有一些新兴的核酸快速检测方法和免疫学检测，如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR法、恒温扩增技术(LAMP)以及Elisa酶联免疫试剂盒。这些快速检测方法虽然都具有高特异性、时间短以及灵敏度高等特点，然而普遍存在的问题就是检测成本高，其中免疫学检测需要制备昂贵的单克隆抗体以及对样品的要求非常高，而基于聚合酶链式反应的核酸检测则需要昂贵的恒温设备，甚至是目前应用最广泛的恒温扩增技术LAMP也逐步暴露了许多局限性，包括引物设计复杂和假阳性高等问题。虽然这些问题在一定程度上都可以避免，但是为了快速检测技术能够得到更大范围普及，必须克服上诉局限性。聚合酶螺旋反应(Polymerase SpiralReaction，PSR)技术，是一种新兴的恒温扩增技术，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，而且仅需要一对引物、不需要精确的变温设备以及操作简单，因此成本低，非常适合在各种工厂和机构进行现场安全性检测和现场护理测试，在食源性微生物检测领域中有非常广阔的发展前景。因此建立一种针对单增李斯特菌的具有独立知识产权的等温核酸扩增方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物。

本发明的另一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的试剂盒。

本发明的又一目的在于提供一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物，包括检测引物Ft和检测引物Bt，其核苷酸序列如下所示：

检测引物Ft:5’-ACACCAGGAGTTCCCATTGCAACCTCGGAGACTTA-3’(SEQ ID NO.1)；

检测引物Bt：5’-TTACCCTTGAGGACCACAGTAGCCTCCAGAGTGAT-3’(SEQ ID NO.2)。