[发明专利]基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括检测单增李斯特菌的引物，2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、以及由钙黄绿素和氯化锰制备的混合溶液；其中，

所述的检测单增李斯特菌的引物由检测引物Ft和检测引物Bt组成，其核苷酸序列如下所示：

检测引物Ft: 5’-ACACCAGGAGTTCCCATTGCAACCTCGGAGACTTA-3’；

检测引物Bt：5’-TTACCCTTGAGGACCACAGTAGCCTCCAGAGTGAT-3’；

所述的2×反应缓冲液由如下组分组成：40.0 mM的Tris-HCl，20.0 mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0 mM的硫酸镁，体积百分比0.2%的Tween 20，1.4 M的甜菜碱，10.0 mM的dNTPs；

所述的混合溶液通过如下方法制备得到：

i）将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配置50 μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置1 mM的氯化锰水溶液；

ii）取25 μL 50 μM的钙黄绿素溶液与10 μL 1 mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的引物中检测引物Ft与Bt的浓度均为50 μM。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的Bst DNA 聚合酶的浓度为8 U/μL。

4.权利要求1～3任一项所述的试剂盒在非疾病诊断目的的检测单增李斯特菌中的应用。

5.一种非疾病诊断目的的基于聚合酶螺旋反应恒温检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取细菌样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8～2.0；

2）于65℃水浴中保温60分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5 μL，50 μM的检测引物Ft和50 μM的检测引物Bt各0.8 μL，DNA模板2.0 μl，8 U/μL的Bst DNA聚合酶1.0 μL，去离子水补足至25 μL；最后加入1 μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；

3）待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟使反应终止，然后用肉眼观察颜色变化，如颜色为黄色，说明细菌样品中不含有单增李斯特菌；如颜色变为绿色，说明细菌样品中含有单增李斯特菌；

步骤2）中所述的检测引物Ft的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，检测引物Bt的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。