[发明专利]一种“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法，具体为应用诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技术建立“人源性”短QT综合征(Short QT syndrome，SQTs)疾病模型的方法。将来自患有SQTs疾病个体的病人皮肤成纤维细胞重编程为iPSCs，再将其定向分化为SQTs病人特异性的心肌细胞，以建立一个稳定的体外心肌细胞疾病模型，并将其用于分析疾病机制、筛选治疗药物，同时应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对病人致病基因的突变位点进行定点校正，再将校正完成的iPSCs分化为心肌细胞，并对其各项指标进行检测，为研究疾病的机制提供基础。

技术领域：

本发明涉及到应用体细胞重编程技术建立病人特异性的诱导多能干细胞株以及应用心肌定向分化技术获得病人特异性的心肌细胞，建立“人源性”短QT 综合征疾病模型，以及CRISPR/Cas9基因组编辑技术的应用。

背景技术：

近年来，已经有很多遗传性心血管疾病被报道并被阐述机理，这其中包括如肥厚型心肌病类结构异常的心血管疾病，以及并没有明显的结构改变但会导致突发性心源性猝死的疾病。长QT间期综合征(Long QT Syndrome,LQTs)是最为大众所熟悉的心脏离子通道病，其在心肌细胞中主要导致钾离子和钠离子通道的异常，但其并不会产生明显的心脏结构病变。最近，人们对此类可能带来严重预后的心脏离子通道病越来越感兴趣，但其在心电图上的反应却和预期并不相同。短QT综合征(Short QT syndrome，SQTs)是一种罕见的，异源性基因遗传的心脏离子通道病，其以心电图QT间期、心室以及心房不应期的缩短为最主要特征，同时存在SCD和恶性心律失常(如心房颤动、室性心动过速)等病变。

有报道指出，约有80％的SQTs病人在睡眠时发生心源性猝死(SCD)，而部分治愈后的病人仍有较大的可能性发生快速型心律失常。所以在过去的几十年中，仍是采用植入型心脏除颤器(ICD)作为SQTs的主要治疗方式。

在分子水平上，常使用心肌细胞的动作电位代表心电图上的QT间期。动作电位幅值的大小与心脏的跳动频率密切相关，因此在使用动作电位作为衡量QT 间期的标准时应先进行标准化校正，得到校正后的QT间期(QTc)。2015年最新发布的欧洲心脏病学会指南指出，正常男性和女性的QTc时长分别为480ms 和360ms。如果QTc≤340ms则认为有较高的风险患有SQTs。同时，当病人的 QTc≤360ms且同时含有以下一个或多个指征时，也被认为有较高的风险患有 SQTs：(1)病人被确认有致病基因突变；(2)家族中有人患有SQTs；(3)整个家族有40年左右的SQTs家族史；(4)有SCD发生经历。此外，SQTs病人可能无明显临床症状或有过心悸以及因房颤引起的眩晕。已经有部分研究者推荐对在校青少年进行ECG检测以筛查疾病，此外，当病人被确诊后，应当对其所有家庭成员均进行临床患病评估。

遗传以及成年后的某些因素均有可能会引起SQTs。2000年，第1例家族性 SQTs被报道。之后，更多的SQTs病人陆续被报道。截至到目前，已有6种SQTs 的亚型被发现。SQTs 1型、2型和3型是与钾离子通道的功能改变有关，而SQTs 4型、5型和6型则与钙离子通道功能缺失有关。KCNH2基因是首先被确定的致病基因突变位点，其编码的电压激活型钾离子通道的孔区亚基属于hERG(human ether-a-go-go)家族，其在整个心脏的动作电位过程中主要影响快速延迟整流的钾电流(Ikr)。研究表明，共有3种基因编码钾离子通道，KCNH2与SQTs1型有关，KCNQ1与SQTs 2型有关，KCNJ2与SQTs 3型有关，而编码钙离子通道的3种基因：CACN1AC、CACNB2和CACNA2D1则分别与SQTs 4型、5型和 6型有关。然而，在高达40％的SQTs病例中，基因分析并不能很准确的确定疾病的遗传信息。此外，SQTs病人同时患有Brugada综合征的这种重叠患有遗传疾病的现象也已经被报道过。患有获得性SQTs的主要原因是电解质失衡，包括高钾血症或高钙血症、心肌缺血、酸中毒或肉碱缺乏症。体温过高有时也会导致 QT间期的缩短。同时，如洋地黄、乙酰胆碱等药物，以及ATP敏感的钾离子通道激活剂也有可能导致QT间期的缩短。