[发明专利]一种“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法

权利要求书

1.一种“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法，其特征在于包括如下步骤：

1)病人皮肤成纤维细胞的获得和培养；

2)将病人的成纤维细胞重编程为SQTs特异性iPSCs；

3)SQTs特异性iPSCs定向分化为心肌细胞；

4)对SQTs特异性iPSCs进行突变位点的定点校正，确定模型建立成功。

2.根据权利要求1所述的“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤1)为：

将病人皮肤块在无菌条件下置入准备好的培养液中；培养皿中加入杜尔贝科磷酸盐缓冲液，将皮肤块转移到培养皿进行冲洗直至皮肤血渍干净为止；

将皮肤块剪成小皮块，配备好1mg/ml的Ⅰ型胶原酶溶液；将剪好的小皮块均匀转移到装有胶原酶溶液的离心管中；将离心管盖紧倾斜放置在37℃培养箱中；待酶消化6-12小时后，从培养箱中取出离心管，转移到新的离心管中并加入配备好的培养基进行离心；

吸除上清，根据离心所得沉淀量加入培养基进行重悬，吹打混匀细胞后，接种，每孔2ml悬液，培养箱中静置培养3至4天后换液。

3.根据权利要求2所述的“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法，其特征在于所述的离心条件为：常温，3000rpm/min，5分钟。

4.根据权利要求1所述的“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤2)为：

待皮肤成纤维细胞达到50-80％的密度，加入仙台病毒到细胞中，反复混匀；转染24小时后撤掉病毒，用新鲜的培养液换液；转染第6天采取隔天更换培养液；转染第7天，吸走培养液，用DPBS漂洗细胞，用0.25ml TrypLE消化细胞，离心，随后，细胞以培养液重悬，以1×10⁵/孔和5×10⁵/孔2个密度接种于基质胶铺底的培养皿中，静置于细胞培养箱中；

24小时后，细胞以mTeSR培养液换液；随后每天换液，转染3-4周后克隆长到合适大小，用枪头在显微镜下挑出若干单个克隆转移到Matrigel铺底的孔板中，命名为第1代，并继续用mTeSR培养液培养；

克隆挑选出7-10天后，以0.5ml的Accutase消化传代至Matrigel铺底的孔板的1孔中，命名为第2代，并继续用mTeSR培养液传代培养；得SQTs特异性iPSCs。

5.根据权利要求1所述的“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤3)为：

首先将iPSCs按1:8-1:12比例接种至6孔板中，每日更换培养基，当细胞密度达到80％进行分化操作，在分化当天，吸尽陈旧培养基，心肌分化培养基RPMI+B27-Insulin清洗一遍，每孔加入含8μM的CHIR的分化培养基2ml，2天后更换成心肌分化培养基，每孔2ml；第3天，每孔加入含5μM的IWR的心肌分化培养基2ml，继续培养2天；第5天更换成心肌分化培养基；第7天以后更换成心肌细胞培养基RPMI+B27+Insulin，此时如果分化效果良好可看到成片跳动的心肌细胞。

6.根据权利要求2或4或5所述的“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法，其特征在于所述的培养液体积配比为89％DMEM加上10％FBS，并添加体积配比为1％的青链霉素双抗。

7.根据权利要求5所述的“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法，所述的心肌分化培养基RPMI+B27-Insulin中，B27-Insulin占总培养基总量的2％；所述的心肌细胞培养基RPMI+B27+Insulin中，B27+Insulin占总培养基总量的2％。

8.根据权利要求1所述的“人源性”短QT综合征疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤4)为：设计guide-RNA引物并合成，合成后使用NEB的BsmBI的体系进行酶切反应；将胶回收后的Oligo产物进行退火处理；处理后的产物使用PCR体系进行连接后，使用T10感受态的大肠杆菌进行菌群的转化扩增；提取长好的菌种后，保存，测序；将测序正确的质粒转染入HEK293细胞系中，加入嘌呤霉素(puromycin)筛选48小时后，提取细胞的RNA并测定浓度；

采用PCR体系进行DNA扩增，对所得DNA进行纯化，并测定纯化后的DNA浓度，对DNA使用T7Endo体系进行酶切反应，将酶切后的DNA转入iPSCs中，将转入DNA接种到含有Matrigel铺底的10mm培养皿中，按比例加入puromycin筛选48小时后挑选长到合适大小的克隆后，继续扩增；将扩增好的细胞进行保存后，提取DNA测序，将测序正确的克隆挑选出来，得“人源性”短QT综合征疾病模型。