[发明专利]一种毛囊干细胞的原代分离方法

说明书

本发明属于干细胞领域，公开了一种毛囊干细胞的原代分离方法，取头皮组织预处理后加中性蛋白酶消化，清洗后顺毛囊生长方向拔出完整的毛囊接种到L‑多聚赖氨酸包被的培养瓶中，加入干细胞专用培养液培养，待细胞汇合度长至80‑90％时传代。实验表明本发明所述原代分离方法可分离出大量毛囊干细胞，且细胞活力好，能够后续稳定培养。

技术领域

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种毛囊干细胞的原代分离方法，尤其是一种人源毛囊干细胞的原代分离方法。

背景技术

皮肤作为人体最大的器官，具有感觉、调节体温、分泌与排泄、防止水分蒸发等多种作用，其中最主要的功能是作为人体与外界环境的屏障以维持内环境的稳定，同时其也是免疫系统的重要组成部分。目前临床上治疗皮肤缺损的标准治疗方法是自体皮肤移植，由于具有无免疫排斥反应，成活率高等特点，其在临床上应用极为广泛，并取得了很好的疗效。但自体皮肤移植的缺点也非常明显，由于是自体取材，其本身就是对患者的再次损伤，极大增加了患者痛苦，而且有发生供皮区感染，不愈合等并发症的风险。更为严重的是，对于上述的大面积皮肤缺损，常由于缺乏足够可供移植的自体皮肤而导致创面修复困难，严重影响了治疗进程，甚至导致死亡。

毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs)是毛囊中的原始细胞，定位在人的毛囊外根鞘隆突部中、最外层靠近立毛肌附着点处。研究发现毛囊干细胞不仅能够分化形成毛囊，有效治疗秃发；而且还参与了表皮组织的形成过程。研究HFSCs对于秃发的发病机制、毛囊组织工程以及干细胞或基因治疗秃发方面均有重要理论和临床意义。毛囊干细胞具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出了高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从患者自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对患者完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。

现有的毛囊干细胞分离方法有组织块法(申请号为201310290238.8，发明名称为《大鼠毛囊干细胞的分离培养方法》)和酶消化法(申请号为201310178143.7发明名称为《一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法》)。其中组织块法无法完整的将毛囊从组织中取出，而酶消化法所用胶原酶或胰蛋白酶对组织损伤较大，影响干细胞的培养。而且上述毛囊干细胞的样本来源都是动物，而动物细胞的活性和人体中细胞的活性不同，利用上述方法分离人源毛囊干细胞，细胞生长缓慢、不易贴壁，无法大规模量化生产，并且所用到部分试剂并不适用于临床科研。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效、稳定、便捷的人源毛囊干细胞的原代分离方法，以便分离出大量毛囊干细胞，并能够后续稳定培养。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种毛囊干细胞的原代分离方法，取头皮组织预处理后加中性蛋白酶消化，清洗后顺毛囊生长方向拔出完整的毛囊接种到L-多聚赖氨酸包被的培养瓶中加入培养液培养，待细胞汇合度长至80-90％时传代。

其中，所述预处理为剪去头皮组织外毛发及皮下组织中的脂肪和结缔组织，剪成3～5mm宽的皮条，用氯化钠注射液清洗后置于75％乙醇中清洗，再用氯化钠注射液清洗后剪成细小组织块。

在一些实施方案中，针对新鲜采集的头皮组织，还需要用含双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液4℃保存用于后续的预处理。其中双抗为青链霉素混合液。青霉素-链霉素溶液(100×)中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。在本发明所述生理盐水及葡萄糖溶液中双抗的浓度优选为1×，即青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。

本发明所述分离方法采用中性蛋白酶对头皮组织进行消化。中性蛋白酶与胰蛋白酶相比更加温和，保障了细胞的活力。

其中，作为优选，所述中性蛋白酶的浓度为0.2U/ml-0.5U/ml。在一些实施方案中，所述中性蛋白酶的浓度为0.5U/ml。