[发明专利]一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法

权利要求书

1.一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法，其步骤包括；

第一步：利用Westernblot分子生物学实验技术定性检测干细胞培养基上清中是否含有bFGF、EGF、KGF蛋白，

第二步：透析袋透析法，在生物大分子的制备过程中，除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品时都要用到透析的技术，根据生长因子EGF的分子量6KD，我们选择最大截留量为3500D的透析袋，

第三步，透析脱水剂的选择，我们选择PEG6000作为吸水剂。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法，其特征在于：所述在第一步中，

1)SDS-PAGE凝胶电泳：首先将细胞进行超声裂解，然后加6xSB后煮样10min，再经过10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，分别取20μg总蛋白上样，蛋白质分子量的标准品为5μL，电泳的初始电压值设置在80V，当染料(溴酚蓝)进入到分离胶之后，电压增加加到110V，待溴酚蓝跑到琼脂糖凝胶电泳的最下方时电泳结束；

2)转膜：待琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)结束后，将10％的琼脂糖凝胶取出，并放置在电转缓冲液里平衡10－20min左右，PVDF膜必须在100％的甲醇中完全浸泡约15-30秒，用蒸馏水检验PVDF膜是否被激活，待膜在水中游动时，将PVDF膜放入电转缓冲液中平衡，凝胶和聚偏二氟乙烯膜(PVDF)一起按照电转仪装置说明书的要求安装，以形成“三明治”结构，再放入电泳槽内，加入500ml电转液，在恒压条件下转膜约1.5h。

3)免疫反应：转膜结束后，将PVDF膜从电转缓冲液中捞出放入事先配置好的脱脂奶粉中(用TBST(20mM Tirs，pH7.6，0.1％Tween，200.2M NaCl)配制的5％(W/V)的脱脂奶粉50ml)封闭，在室温下PVDF膜封闭大约1h或放在4度过夜，然后用TBST洗膜3次，每次10min，再加入用脱脂奶粉稀释好的一抗(bFGF、EGF、KGF)，4℃条件下孵育过夜，用TBST缓冲液洗膜3次，每次5min，再以HRP标记的二抗(鼠源、兔源全式金)室温下孵育1h，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min，

4)曝光：在暗室中，将配制好的ECL plus western blotting Detection Reagents工作液倒出备用，并且要按照说明书将A、B反应液1：1混匀后(P3代细胞状态稍微差的培养基上清记为A，P3代细胞状态好的培养基上清记为B)，迅速的加至PVDF膜上作用90s，用干净的滤纸吸去膜上的反应液，用保鲜膜包PVDF膜并放入曝光夹中，在膜上放比PVDF膜略微大的X-光片，立刻盖紧曝光夹，第一次曝光10秒，取出X-光片，放于显影液里当胶片上清晰的显示出特异性的条带后，立即放入蒸馏水中目的是洗去显影液，然后在定影液中定影使X-光片变透明，最后图象的扫描，以备用于研究，

根据权利要求1所述的一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法，其特征在于：所述在第二步中，

透析袋的使用方法如下：

1).将透析管剪成适当长度(10-20cm)的小段，即成透析袋；

2).在大体积的2％(m/v)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(PH＝8)中将透析袋煮沸10min；

3).将透析袋用蒸馏水彻底漂洗；

4).将透析袋置1mmol/LEDTA(PH＝8)中煮沸10min；

5).透析袋冷却后存放于4度，应确保透析袋始终浸没在液体中；

注:从此步起用透析袋时一定要戴手套操作；

6).在使用之前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞生长因子原液的制备工艺方法，其特征在于：所述在第三步中，

只需将装有样品的透析袋放在干净的诸如铝箔纸上，然后覆盖一层PEG6000透析脱水，水和其它小分子物质就可以被透析脱水剂吸收掉。