[发明专利]一种犬早孕检测试剂条的制备及使用方法

说明书

本发明提供一种犬早孕检测试剂条的制备及使用方法，样本垫的处理：将样本垫置于含有1％BSA、0.5％Tween‑20、0.1％NaN3的0.02mol/L PB缓冲液中，浸泡3min后放置在60℃真空干燥箱中充分干燥备用；荧光微球结合垫的制备：将RLN标记的荧光纳米微球和鸡IgG标记的荧光纳米微球，使用上海金标喷金划膜仪喷在荧光结合垫上，35℃干燥过夜处理；本试剂填补国内没有犬早孕检测试剂的空白，实现犬松弛素的定性、定量、快速检测，在交配后最快15天，即可检测出是否怀孕，大大早于外部观察法、触诊法的20天检测以及超声波的30天检测。

技术领域

本发明是一种犬早孕检测试剂条的制备及使用方法，属于基因工程领域。

背景技术

现有技术中，母犬的妊娠诊断方法很多，目前较常用的方法有外部观察法、触诊检查法、超声波探测法等。触诊检查法：当母犬怀孕20天左右，子宫开始变的粗大，在腹壁触摸可以明显感知子宫直径变粗。外部观察法和触诊法均需要有相当经验的人才能作出较正确的诊断。妊娠25天后，可以触摸到胎儿(如摸到有鸡蛋大小、富有弹性的肉球)。超声波探测可用于发现怀孕19-25天的胎犬心脏跳动。随着胎犬的发育，其准确率增加，怀孕36-42天的准确率为85％。体型太小的母犬，由于腹部动脉的跳动，误诊率稍高，所以需要一种新的检测方法来解决上述问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种犬早孕检测试剂条的制备及使用方法，以解决上述背景技术中提出的问题，本发明使用方便，便于操作，稳定性好，可靠性高。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种犬早孕检测试剂条的制备，包括如下步骤：

S1：样本垫的处理：将样本垫置于含有1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN3的0.02mol/L PB缓冲液中，浸泡3min后放置在60℃真空干燥箱中充分干燥备用；

S2：荧光微球结合垫的制备：将RLN标记的荧光纳米微球和鸡IgG标记的荧光纳米微球，使用上海金标喷金划膜仪喷在荧光结合垫上，35℃干燥过夜处理；

S3：T、C线的制备：使用抗体稀释液(pH7.4的PBS缓冲液和体积比为0.05％Proclin300组成)对山羊IgG和RLN包被抗体R014进行稀释，使用喷金划膜仪均匀喷在NC膜的质控线和检测线上，两线距离5mm，喷完后35℃干燥过夜备用；

S4：试剂条组装：将样本垫、结合垫、NC膜、吸水纸依次搭接地粘贴在PVC底板上，用切条机切成4.0mm宽的试纸条，置于有干燥剂的锡箔袋中密封保存。

进一步地，所述荧光纳米微球通过使用粒径200nm铕离子荧光微球，抗体标记使用的是EDC和NHS活化微球上的羧基，活化后的羧基与蛋白上的氨基结合使Eu-CM偶联上蛋白，参照微球说明书进行标记，抗体微球按照质量比为1：10进行标记实验，用0.05mol/l吗啉乙磺酸缓冲液(MES)离心洗涤铕离子荧光微球2次，按照每毫克微球分别加入等质量的EDC和NHS，室温下震荡反应30min，12000g离心去除上清(以除去多余的EDC和NHS)，使用MES缓冲液清洗沉淀2次，按量加入检测抗体E001，室温震荡反应2h，12000g离心去除上清，用pH7.5PBS缓冲液洗涤沉淀2次并复溶于PBS缓冲液中，然后加入封闭缓冲液(由0.05mol/lTris、5％牛血清白蛋白(w/v)、0.05％Triton X-100(v/v)和0.09％叠氮化钠(w/v)组成，封闭缓冲液的pH值为7.5)进行封闭，4℃封闭过夜，使用PBS洗涤2次，4℃保存备使用。