[发明专利]一种犬早孕检测试剂条的制备及使用方法

权利要求书

1.一种犬早孕检测试剂条的制备，其特征在于包括如下步骤：

S1：样本垫的处理：将样本垫置于含有1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN3的0.02mol/LPB缓冲液中，浸泡3min后放置在60℃真空干燥箱中充分干燥备用；

S2：荧光微球结合垫的制备：将RLN标记的荧光纳米微球和鸡IgG标记的荧光纳米微球，使用上海金标喷金划膜仪喷在荧光结合垫上，35℃干燥过夜处理；

S3：T、C线的制备：使用抗体稀释液(pH7.4的PBS缓冲液和体积比为0.05％Proclin300组成)对山羊IgG和RLN包被抗体R014进行稀释，使用喷金划膜仪均匀喷在NC膜的质控线和检测线上，两线距离5mm，喷完后35℃干燥过夜备用；

S4：试剂条组装：将样本垫、结合垫、NC膜、吸水纸依次搭接地粘贴在PVC底板上，用切条机切成4.0mm宽的试纸条，置于有干燥剂的锡箔袋中密封保存。

2.根据权利要求1所述的一种犬早孕检测试剂条的制备，其特征在于：所述荧光纳米微球通过使用粒径200nm铕离子荧光微球，抗体标记使用的是EDC和NHS活化微球上的羧基，活化后的羧基与蛋白上的氨基结合使Eu-CM偶联上蛋白，参照微球说明书进行标记，抗体微球按照质量比为1：10进行标记实验，用0.05mol/l吗啉乙磺酸缓冲液(MES)离心洗涤铕离子荧光微球2次，按照每毫克微球分别加入等质量的EDC和NHS，室温下震荡反应30min，12000g离心去除上清(以除去多余的EDC和NHS)，使用MES缓冲液清洗沉淀2次，按量加入检测抗体E001，室温震荡反应2h，12000g离心去除上清，用pH7.5PBS缓冲液洗涤沉淀2次并复溶于PBS缓冲液中，然后加入封闭缓冲液(由0.05mol/l Tris、5％牛血清白蛋白(w/v)、0.05％Triton X-100(v/v)和0.09％叠氮化钠(w/v)组成，封闭缓冲液的pH值为7.5)进行封闭，4℃封闭过夜，使用PBS洗涤2次，4℃保存备使用。

3.根据权利要求1所述的一种犬早孕检测试剂条的制备，其特征在于：所述检测抗体E001与包被抗体R014通过将纯化的犬松弛素与载体蛋白KLH交联，以常规方法与福氏佐剂混合后免疫Balb/C小鼠，50微克/只，2周/次，经过5次皮下免疫后，测定效价在1：320000以上，分离脾脏，与骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的犬松弛素为抗原，间接ELISA法筛选松弛素单克隆抗体，用竞争抑制法对获得的特异性克隆进行配对，筛选得到配对抗体的检测抗体E001和包被抗体R014。

4.根据权利要求3所述的一种犬早孕检测试剂条的制备，其特征在于：所述犬松弛素通过将松弛素B肽链和A肽链分别在N端添加大肠杆菌蛋白信号肽设计成分泌肽链，在同一表达载体于大肠杆菌膜外周间隙分泌表达，并在膜外周间隙的氧化环境中形成B肽链和A肽链间的二硫键，自组装成成熟的犬松弛素。

5.根据权利要求3所述的一种犬早孕检测试剂条的使用方法，其特征在于：使用抗原稀释液(PBS缓冲液+1％BSA+0.5％Tween20)稀释血清样本，震荡混匀，取100μl血清混悬液，加入检测卡的加样孔中，10分钟后通过荧光检测仪分别检测T、C线位置的荧光信号，仪器将T、C位置的荧光信号换算成数字信息，并计算出T、C位置荧光信号强度的比值，用ELISACalc软件绘制标准曲线。