[发明专利]一种牙髓间充质干细胞的制备、培养及纯化方法

说明书

本发明提供了一种牙髓间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：向牙髓组织加入组织消化液进行消化；消化结束后再加入H‑DMEM培养液稀释消化液，滤除牙齿碎片，滤液离心去除上清液，得到沉淀；用H‑DMEM培养液清洗所述沉淀，再次离心去上清，得到分离后的牙髓间充质干细胞。本发明的方法能够有效制备、分离和纯化牙髓间充质干细胞。

技术领域

本发明属于干细胞与再生医学领域，具体涉及一种牙髓间充质干细胞的制备、培养及纯化方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是一类具有自我复制和多向分化能力的干细胞，在一定条件下可以分化为骨骼、软骨、神经、表皮等多种功能细胞，在再生医学领域中具有重要的应用前景。间充质干细胞存在于人体多种组织中，如常见的骨髓、脐带华通胶、脐带血、胎盘等组织，但是骨髓来源的间充质干细胞存在取材困难，对人体伤害大等问题；脐带和胎盘等组织中的间充质干细胞具有活性高、增殖能力强，取材对身体无损害的优点，但是其组织只能在分娩期间采集，错过时机将无法挽回。

牙髓间充质干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是Gronthos于2000年提出的概念，牙髓间充质干细胞存在于牙髓腔中，是胚胎发育过程中神经嵴细胞发育而来，在体外具有和骨髓间充质干细胞极为相似的免疫表型和矿化结节能力，而且相比骨髓间充质干细胞具有更高的增殖活性。乳牙是儿童在10岁左右换牙期间脱落的牙齿，牙髓中的牙髓间充质干细胞具有很高是增殖活性和克隆形成能力，并可以分化为包括神经细胞、脂肪细胞和牙本质细胞在内的各种细胞，把体外培养的细胞移植到小鼠体内可以形成骨组织和牙本质组织。乳牙中的牙髓间充质干细胞采集方便，儿童换牙过程中有超过20次的采集机会且无痛无创。乳牙在发育方面与颌骨组织具有相同的来源，采集的乳牙牙髓间充质干细胞可以用来修复牙周炎引起的牙本质缺损或颌骨部分缺损是非常合适的选择。

现阶段牙髓间充质干细胞制备方法一般都是取出牙髓组织后采用酶消化或者组织植块的方法分离其中的间充质干细胞，但是牙髓组织富含血管和神经等其他组织，通过酶消化得到的细胞纯度低，可能混合大量的内皮细胞、成纤维细胞等杂细胞，这些细胞在正常的生长过程中与间充质干细胞争夺营养，对间充质干细胞培养带来不利影响；而组织植块发细胞迁移速度慢，部分细胞残留组织块中无法全部迁移出来造成细胞损失，为后期牙髓间充质干细胞的临床应用带来不便。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供能够有效制备、分离和纯化牙髓间充质干细胞的方法。

为此，本发明提供了以下技术方案。

一种牙髓间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：

(1)向牙髓组织加入组织消化液进行消化；

(2)消化结束后再加入H-DMEM培养液稀释消化液，滤除牙齿碎片，滤液离心去除上清液，得到沉淀；

(3)用H-DMEM培养液清洗所述沉淀，再次离心去上清，得到分离后的牙髓间充质干细胞。

优选地，所述组织消化液包括H-DMEM、基于所述H-DMEM体积2mg/ml的中性蛋白酶、1mg/ml的I型胶原酶和0.5mg/ml的DNA酶。

优选地，所述牙髓组织来源于儿童换牙过程中自然脱落的乳牙。

更优选地，将乳牙用酒精(如75％的医用酒精)消毒后，用组织清洗液清洗，压碎后剔除破碎的牙齿碎片，获得牙髓组织。组织清洗液由生理盐水添加按生理盐水体积计25μg/ml的硫酸庆大霉素和5μg/ml的两性霉素B配制。

本发明还提供了一种牙髓间充质干细胞的培养及纯化方法，其包括：在得到牙髓间充质干细胞后，使用选择培养基进行细胞培养。