[发明专利]一种零背景的多片段基因高效率组装方法

说明书

本发明公开了一种零背景的多片段基因高效率组装方法，包括如下步骤：构建puc57‑CATP载体；构建克隆有CATP基因片段的质粒；选择目标基因，根据基因长度分为小片段进行基因合成，基因两端添加二类酶位点，连接到克隆载体；多个小片段包括已构建的CATP基因片段用Golden gate克隆反应进行组装，使用T7DNA聚合酶作为连接酶，组装产物转化大肠杆菌，涂布于氨苄和氯霉素抗性的LB平板进行筛选。载体质粒在无需预先经过线性化等处理情况下，通过独特的载体和片段设计，一次性同时高效组装多个基因片段；使用保真性更高的T7DNA连接酶，提高了片段正确组装的概率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种零背景的多片段基因高效率组装方法。

背景技术

基因克隆近年来在农业、畜牧业和医药方面取得丰硕成果，其基本原理是把外源基因与克隆载体进行体外连接，继而转化宿主细胞，筛选出含有目的基因重组质粒的转化子。

传统的基因克隆步骤包括:选择目的基因并设计相应引物；用引物PCR扩增目的基因片段；选择合适(抗性标记、酶切位点等)的克隆载体(为了保真扩增)，并将PCR片段连接入克隆载体中，(一般用Taq酶的PCR产物在末尾会自带一个A，可以在Solution 1 作用下与两端各带一个T的线性载体连接)。

随着分子生物学的发展，人们对多基因片段的合成需求随之增长。Golden gate克隆是常用的方法之一，其原理是在小片段两端添加IIs型限制性内切酶识别位点，利用同一种限制性内切酶产生的不同粘性末端，从而一次性组装多个基因片段。

然而常规的Golden gate克隆方法使用的T4 DNA连接酶可以催化粘性末端或平末端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，满足3/4一致的两个粘性末端均能被催化退火，其次T4 DNA连接酶的保真性较低，因此使用传统的T4 DNA 连接酶在做Golden gate克隆时需要谨慎地设计多个片段的粘性末端，以避免出现粘性末端3/4或者反向3/4一样的情况出现，而设计不合理的Golden gate克隆，使用T4 DNA连接酶往往难以得到正确的克隆，连接倾向于形成更少的片段相互连接，使得连接效率进一步降低。

传统的Golden gate克隆产物在转化大肠杆菌后，仍然会有少量连接酶将载体和载体被酶切的小片段错连或少连，以及未切干净的载体和少量的PCR模板，这样对于后续的菌落筛选形成了很大的背景干扰。随之而来的这些背景干扰会在大肠杆菌复制的过程中逐渐富集，占据平板克隆总数目的绝大部分，导致组装成功率大幅度降低，甚至组装失败。

因此，我们发明并改进了一种用于克隆过程中零背景的高效率重组基因的方法。载体质粒在无需预先经过线性化等处理情况下，可以在同一体系中进行限制性内切酶消化和连接，有效地提高多片段连接的准确性；并且通过人为额外添加一段氯霉素抗性基因，可避免克隆载体自身以及PCR模板产生的干扰背景，进行高达10个片段的无缝连接。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种零背景的高效多基因片段构建方法，以解决背景技术中提出的问题。

一种零背景的高效组装基因的克隆方法，其步骤包括：

步骤一构建puc57-CATP载体；

步骤二构建克隆有CATP基因片段的质粒；

步骤三选择目标基因，根据基因长度分为小片段进行基因合成，基因两端添加二类酶位点，连接到克隆载体；

步骤四多个小片段包括已构建的CATP基因片段用Golden gate克隆反应进行组装，使用T7 DNA聚合酶而不是T4 DNA聚合酶作为连接酶，能够提高正确组装的概率。组装产物转化大肠杆菌，涂布于氨苄和氯霉素抗性的LB平板进行筛选。

优选地，步骤一具体分为如下步骤：