[发明专利]一种零背景的多片段基因高效率组装方法

权利要求书

1.一种零背景的多片段基因高效率组装方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一构建puc57-CATP载体；

步骤二构建克隆有CATP基因片段的质粒；

步骤三选择目标基因，根据基因长度分为小片段进行基因合成，基因两端添加二类酶位点，连接到克隆载体；

步骤四多个小片段包括已构建的CATP基因片段用Golden gate克隆反应进行组装，使用T7 DNA聚合酶作为连接酶，组装产物转化大肠杆菌，涂布于氨苄和氯霉素抗性的LB平板进行筛选。

2.根据权利要求1所述的零背景的多片段基因高效率组装方法，其特征在于：步骤一具体分为如下步骤：

(1)puc57-CATP载体包括复制子，氨苄抗性基因和多克隆位点区域，以pCATP-PF/pCATP-PR分别作为上、下游引物PCR扩增获得产物，并回收纯化；

(2)以puc57为载体，用EcoR I和HindIII进行双酶切，使用柱回收纯化酶切产物，将步骤(1)获得的PCR产物和酶切后的线性化载体用Gibson重组连接；

(3)重组产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，具体步骤如下：

A.在2mL离心管中加入50μL冰上融化的TOP10感受态细胞和5μL连接产物，轻轻混匀；

B.将离心管在冰上放置30min后，于42℃水浴中热激60s，立即将离心管置于冰上冷却2min；

C.加入600μL LB液体培养基，轻轻混匀，37℃，200rpm，恒温振荡培养45min；

D.5000rpm离心5min，留200μL菌液涂于IPTG及X-gal的LB固体培养基上，其中固体培养基含50mg/L氨苄霉素；

E.涂板正放于37℃恒温箱中5min，再倒置培养12h长出单克隆；

(4)重组克隆的鉴定

挑取多个单克隆于4mL LB液体培养基中，其中液体培养基含50mg/L氨苄霉素，37℃振荡培养12h至菌液浑浊，抽提质粒并测序。

3.根据权利要求1所述的零背景的多片段基因高效率组装方法，其特征在于，步骤二具体分为如下步骤：

(1)CATP质粒为氯霉素抗性基因的阅读框序列，不包括起始密码子ATG以及上游的启动子序列，基因两端为二类酶酶切位点，二类酶BsaI酶切后形成的片段粘性末端分别为GCTT和ACGG，粘性末端ACGG和BsaI酶切后的载体puc57-CATP连接；

(2)以pACYC-Duet1为模板，用引物CATP-PF/CATP-PR扩增片段，得到的PCR片段胶回收后平端连接EcoRV线性化的pUC57载体；

(3)连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞；

(4)重组克隆的鉴定。

4.根据权利要求1所述的零背景的多片段基因高效率组装方法，其特征在于，步骤三具体分为如下步骤：

(1)目标片段分为小片段，并添加二类酶位点

目的基因无二类酶位点BsaI，目的基因根据长度分为小片段，设计首尾引物扩增小片段，或通过基因合成合成目的基因的小片段，基因两端添加二类酶BsaI位点及粘性末端，多个基因片段的粘性末端设计原则为：第一个片段5’粘性末端和线性化载体头部一致，为GAAT；最后一个片段的3’粘性末端和线性化载体尾部一致，为GCTT；不同基因片段的4bp的粘性末端互不相同，互不反向互补，避免出现4个碱基中存在连续3个碱基相同或反向互补，

(2)小片段连接到克隆载体

几个小片段的PCR产物胶回收后，分别连接到EcoRV线性化的pUC57载体；

(3)连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞

(4)重组克隆的鉴定。

5.根据权利要求1所述的零背景的多片段基因高效率组装方法，其特征在于，步骤四具体分为如下步骤：

(1)按照如下体系在0.2mLPCR管内配置组装反应，

(2)反应体系配置完成后，把0.2mL PCR管放在PCR仪器上盖好橡胶垫，按照下面的PCR反应条件设置反应程序。