[发明专利]表达错义突变的FLNB基因的细胞模型、构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种表达突变的FLNB基因的细胞模型，所述表达错义突变的FLNB基因所用的细胞为ATDC5细胞。本发明充分表明FLNB基因的生理及病理性功能具有显著的细胞类型特异性，也解释了为何FLNB基因仅影响骨骼系统。本发明还提出了不同位点的错义突变通过其对细胞形态、凋亡、迁移及下游的信号传导通路等作用之间的相互制衡，导致彼此间互不相同的骨骼系统畸形的表型。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种表达错义突变的FLNB基因的细胞模型、构建方法与应用。

背景技术

已有研究表明，非随机性分布的细丝蛋白B基因(Filamin B，FLNB) 错义突变位点可导致一组常染色体显性遗传、继发于骨发育不良(bone hypoplasia)的骨骼畸形疾病，包括Larsen综合征(Larsen syndrome，LS)、骨发育不全症(atelosteogenesis，AO)、回飞镖样骨发育不全症(boomerang dysplasia，BD)。非随机分布的FLNB基因无义突变可以导致另外一种隐形遗传的骨骼畸形疾病，即脊柱-腕-跗骨融合症(spondylocarpotarsalsynostosis syndrome,SCT)。LS是位于该疾病谱中骨发育不良程度最低的一端，而BD 则位于该疾病谱中骨发育不良程度最高的一端。LS表现出的骨骼畸形包括脊柱侧凸、颈椎后凸畸形、腕骨及跗骨增多、大关节的脱位和诸如前额突起、眼距增宽及鼻梁塌陷等畸形。BD是一种致死性骨发育不良疾病，其特征为肢体长骨、椎体及髋臼的发育不良，甚至是上述骨结构的缺损或完全缺失。脊柱-腕-跗骨融合症(spondylocarpotarsal synostosissyndrome,SCT,OMIM 272460)，其典型表现为腕骨或跗骨的提前融合、及由椎体间融合导致的脊柱生长不平衡而进而引起的脊柱侧凸畸形。

根据现有报道，FLNB基因突变对骨骼畸形的致病性机理包括长骨生长板骨化延迟、软骨细胞的迁移能力下降以及软骨细胞的增殖、分化及凋亡过程的紊乱。然而，这些研究中大部分都集中在出现数量较少的FLNB无义突变导致的SCT上，而对于出现数量较多的FLNB基因错义突变导致的疾病，则研究较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达突变的FLNB基因的细胞模型，该模型为研究错义突变的FLNB基因导致的疾病提供了研究基础。

为实现上述目的，本发明首先提供一种表达突变的FLNB基因的细胞模型，其特征在于，所述表达突变的FLNB基因所用的细胞为ATDC5细胞。

优选地，所述突变的FLNB基因包括含有突变位点c.4756G>A的FLNB 基因、含有突变位点c.512T>G的FLNB基因、导致骨发育不良的突变基因、导致骨化中心提前融合的骨骼畸形疾病的突变基因或导致先天性脊柱侧凸的突变基因。

优选地，所述FLNB基因不同位点的突变，通过其对细胞形态、凋亡、迁移及下游的信号传导通路等作用之间的相互制衡，可导致所述ATDC5细胞产生不同的的骨骼系统畸形的表型。本发明的第二方面提供了以上所述细胞模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)FLNB全长cDNA基因的5’端组装标记基因后进行扩增；

(2)将步骤(1)中获得的基因进行位点c.4756G>A或位点c.512T>G 的定点突变；

(3)将步骤(2)中获得的突变基因与载体相连构建表达载体；

(4)将步骤(3)获得的表达载体通过转染导入ATDC5细胞，经过筛选及鉴定得到稳定表达错义突变的FLNB基因的细胞模型。

优选地，步骤(1)中所述标记基因为增强绿色荧光蛋白基因。

优选地，步骤(2)中所述定点突变采用PCR诱导定点突变。

优选地，所述PCR诱导定点突变所使用引物如下：