[发明专利]一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌及应用

说明书

本发明涉及一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8‑H，通过将来源于黑曲霉CICC2462菌的木聚糖酶xynB基因构建表达盒，利用rDNA整合法构建得到8拷贝木聚糖酶基因菌株，木聚糖酶表达量325U/mL，通过转化pYES6‑PGK‑HAC1片段到该菌株得到过表达HAC1 8拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌，木聚糖表达量达到381U/mL，过表达HAC1提高了与内质网蛋白折叠相关基因表达水平，同时本发明提供了一种酿酒酵母菌分泌表达多拷贝外源基因的模型，可利用该模型构建表达其他基因,本发明所提供的高产木聚糖酶酿酒酵母菌株可优势的应用于秸秆降解，饲料制造过程中。

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8-H及其应用。

背景技术

木聚糖酶(xylanase)是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，它不仅在能源工业上可发挥巨大作用，在饲料、造纸、食品等领域也有着广阔的应用前景。而制约我国木聚糖酶生产与应用的主要限制性因素是缺乏能够与规模化生产相适应的高产菌株，因此，开发出具有我国自主知识产权的高产木聚糖酶新菌系迫在眉睫。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是美国食品与药品管理局(FDA)认定的一种安全菌株，是食品与饲用酶制剂表达的理想宿主。酿酒酵母生物学和遗传学背景清楚，既具有原核生物生长繁殖快、遗传操作简单的特点，又具有真核生物对外源蛋白进行翻译后修饰加工的能力，近年来，在外源基因表达方面得到了深入研究和广泛应用。

启动子是表达载体的一个重要元件，它是影响mRNA分子合成速率的主要因素之一，一个强的启动子能有利于载体表达更高水平的外源蛋白。信号肽是引导新合成肽链转移到内质网中的一段短肽，利用信号肽来引导新合成的外源蛋白定位分泌到细胞的特定区间，提高外源蛋白的可溶性。核糖体DNA(ribosomal DNA，rDNA)序列是指细胞核中编码核糖体RNA的DNA序列，它是一段高度重复序列，其重复单位由转录区段和非转录区段组成。在酿酒酵母的XII染色体中，rDNA存在100～140个重复单位。如果以酿酒酵母rDNA序列为整合位点，从理论上说，可以得到100～140个目的基因拷贝数。依赖于rDNA重复序列整合的外源基因导入酿酒酵母后，外源基因在酵母细胞内的表达会由于剂量效应而实现高效表达，但是否拷贝数越多，外源基因表达量越高还值得探讨。

在酿酒酵母表达系统中，非正确折叠蛋白的产生和积累，尤其是多拷贝所导致的过表达蛋白不能正确折叠分泌出细胞，积累于内质网上，诱发内质网相关的蛋白降解(ERAD)途径，进而被ER蛋白酶降解，这是影响外源蛋白高效表达的核心与关键。HAC1基因是UPR通路中的转录调控蛋白，能作用于大量与蛋白折叠和组装相关的分子伴侣。为了增强外源基因的表达量，制备分泌型的基因表达盒，得到木聚糖酶基因的最优拷贝量，同时选择优势的调控基因去增强内质网蛋白折叠相关基因表达水平，成为目前的研究热点及难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8-H，本发明通过将来源于黑曲霉CICC2462菌的木聚糖酶xynB基因构建表达盒，利用rDNA整合法构建得到8拷贝木聚糖酶基因载体，通过连接过表转录因子HAC1基因得到优化的8拷贝木聚糖酶酿酒酵母木聚糖酶菌株。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株S8-H，其特征在于：

1、重叠延伸PCR法构建PαXC表达盒