[发明专利]一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌及应用

权利要求书

1.一种高产木聚糖酶酿酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株含有木聚糖酶xynB基因，序列如SEQ ID NO：23；所述菌株含有8拷贝木聚糖酶基因表达盒PαXC，PαXC序列如SEQ ID NO：9；所述菌株含有过表达基因HAC1，序列如SEQ ID NO：27，所述菌株以酿酒酵母菌为工程菌；

所述8拷贝的木聚糖酶基因表达盒PαXC包括以下元件：（a）起始信号元件为PGK，序列如SEQ ID NO：24；（b）分泌信号肽α-factor，序列如SEQ ID NO：25；（c）木聚糖酶xynB基因；（d）终止子CYC1，序列如SEQ ID NO：26；所述8拷贝的木聚糖酶基因表达盒PαXC构建按如下进行：

①重叠延伸PCR法构建PαXC表达盒：以黑曲霉CICC2462菌种扩增木聚糖酶xynB基因，以S. Cerevisiae INVSc1基因组DNA为模板扩增PGK启动子序列、序列如SEQ ID NO：24，以pPIC9K质粒为模板扩增分泌信号肽α-factor序列、序列如SEQ ID NO：25，以pSH65质粒扩增终止子CYC1序列、序列如SEQ ID NO：26，利用重叠延伸PCR的方法将四段序列串联成PGK-α-factor-xynB-CYC1表达盒PαXC，将PαXC表达盒连接至pMD19-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5α，提取pMD19-T-PαXC质粒测序验证序列是否正确，其核苷酸编码序列如 SEQ ID NO：9；

②S. Cerevisiae INVSc1-pYES2-PαXC-rDNA工程菌的构建：对pMD19-T-PαXC和pYES2分别双酶切后连接转化感受态大肠杆菌DH5α，得到pYES2-PαXC载体，以S. CerevisiaeINVSc1基因组DNA为模板，扩增rDNA单元中的核心序列、核苷酸编码序列如 SEQ ID NO：10，对pYES2-PαXC和pMD19-T-rDNA分别经SnaBI单酶切后，回收目的片段，T4连接酶连接，测序验证，得到pYES2-PαXC-rDNA表达载体，对pYES2-PαXC-rDNA载体经SphI在rDNA位置进行线性化后，采用LiAc/ssDNA法转化感受态S. Cerevisiae INVSc1，转化后体系涂布于SC-U培养基，3-5d后长出单菌落；

③微滴数字PCR鉴定转化子拷贝数

将的阳性转化子，接种于YPD培养基中，培养48h后，收集菌体，用Omega酵母基因组提取试剂盒提取DNA，以DNA为模板，ATC1基因为内参、序列如SEQ ID NO：13，利用BIO-RAD QX200数字液滴PCR进行xynB基因拷贝数鉴定，并使用软件QuantaSoft V1.3.2.0分析分析实验数据，获得绝对定量结果，选择8拷贝菌株。