[发明专利]一种靶向EGFR和CD19双靶点的嵌合抗原受体方法

说明书

本发明涉及靶向EGFR和CD19双靶点的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接的抗EGFR单链抗体的编码序列、抗CD19单链抗体的编码序列、人IgG4铰链区的编码序列、人CD28跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。本发明制备的CART细胞带有Mask序列，当进入实体瘤肿瘤微环境内因其具有蛋白酶能把Mask序列切割掉暴露出抗EGFR单链抗体使其发挥作用。

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，具体涉及靶向EGFR和CD19双靶点的嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

脑胶质母细胞瘤GBM(Glioblastoma multiforme)是最常见的脑肿瘤，手术治疗、放疗及结合替莫唑胺的辅助化疗是临床主要的治疗方法，但胶质母细胞瘤临床治疗效果不理想，中位生存期仅在12个月内，易复发预后差。表皮生长因子受体EGFR(epidermalgrowth factor receptor)基因扩增、突变和重排与肿瘤生长、血管生成及肿瘤的进展和治疗耐性密切相关。

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，自其于1962年发现之日起至今，生长因子与EGFR之间的关系的研究已取得了极大的起色。此中ErbB家族我们对其最为了解，这个受体家族包括表皮生长因子受体(EGFR，又叫做ErbB1/HER1)、ErbB2(又被称为p185Neu/HER2)，ErbB3和ErbB4(又被称为HER4)，四个家族组成部分均由胞外配体结合部分)、跨膜部分(在胞外和胞内起信息传导作用)和细胞内部分(包括胞体内活化部分与下游配体)。下游底物的活化和基因转录与细胞分裂、增殖及细胞死亡、迁移和侵袭等密切相关。这些受体被证实在人类肿瘤中过表达、扩增或重排。在所有的突变体中，最常见的突变体是表皮生长因子受体Ⅲ型突变体，EGFRvlII研究证明其有促成肿瘤的发展和形成。EGFRvlII首先在胶质母细胞瘤研究中被发现，由于mRNA剪切或基因重排致第2至第7外显子缺失，EGFRvlII缺失与配体相结合的胞外区267个氨基酸，融合位点处生成一个新的甘氨酸。缺失了胞外配体结合区的EGFRvlII可以在没有配体结合的情况下，致受体不依赖于配体的组成性激活酪氨酸激酶，激活下游的多条信号传导通路，包括磷酸磷脂酰肌醇3羟基激酶(PI3K)/Akt1、Ras和丝裂原活化蛋白激酶等多条信号传导通路，引起级联反应,促进瘤细胞增殖、血管生成、抑制凋亡等。EGFRvlII可使肿瘤细胞表型发生转化，表现为致瘤性、侵袭力增强。EGFRvlII信号传导能力的增强使EGFRvlII活性和致瘤性增加，这可能与受损的内吞作用、延长信号的时间、无效地泛素化和增强受体的二聚化等因素有关。