[发明专利]一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法

说明书

本发明公开了一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D‑氨基酸的方法，该方法是将鹅去氧胆酸和α‑酮酸置于含7α‑HSDH和DAADH及NADP的溶液体系中进行酶催化反应，反应液采用超滤膜分离得到浓缩混合酶液，透析液经过调节pH进行结晶，过滤分离，得到7‑KLCA湿粉和滤液；滤液通过层析处理得到D‑氨基酸；7‑KLCA湿粉置于含葡萄糖、NADP、7β‑HSDH及GDH溶液体系中进行酶催化反应，反应液采用超滤膜分离，得到浓缩的混合酶液，透析液通过结晶、过滤分离，得到熊去氧胆酸。该方法可以同时获得UDCA和高手性纯度的D‑氨基酸，且酶利用率高，简化了合成步骤，成本降低，同时，反应过程不需加入金属还原试剂和有机溶剂，条件温和，环境友好，适于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种熊去氧胆酸和D-氨基酸的合成方法，特别涉及一种利用酶法偶联技术合成熊去氧胆酸(UDCA)和高手性纯度D-氨基酸的方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid，UDCA)，化学名为3α，7β-二羟基-5β-胆烷酸，被人们从熊胆中被发现。目前，UDCA在临床上被广泛用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，同时也能提高肝脏移植手术后的成活率。

天然熊去氧胆酸来源于熊胆汁，即活熊胆汁引流。然而随着市场的需求量不断增加以及活熊取胆有违野生动物保护法，天然熊去氧胆酸早已不能满足市场需求。因此，通过人工合成获得熊去氧胆酸变得越来越重要。

目前，国内外主要以鹅去氧胆酸(CDCA)为原料，通过化学法或酶法制备UDCA。化学法通过对CDCA的氧化和还原反应，制备UDCA，中间用到了大量的有机溶剂和氧化还原试剂，且处理过程复杂，产生的废水很难处理。中国专利CN105861613A报道了采用酶法制备UDCA的方法，但是反应体系中加入了大量有机试剂，生产过程中需要对溶剂进行回收处理。其主要目的是利用高温的条件下酶蛋白在有机溶剂中变性从而可以与UDCA分离开，达到纯化的目的。氨基酸是非天然氨基酸的一类，具有非天然氨基酸所不具备的优良性能，已经在药物合成(医药和农药)、食品、饲料等方面有广泛的用途。目前，主要有化学法和酶法制备D-氨基酸两种途径，其中化学法反应条件比较剧烈，对环境污染大，成本高，不适应大规模工业化生产。酶法制备技术又主要分为以下两种：第一，以D，L氨基酸为原料，采用酶法拆分技术，该方法需要拆分试剂，收率不高；第二种是以海因为原料，通过海因酶和氨甲酰水解酶共同作用制备，该方法的缺点是产品有局限性，比较适应于带苯环的D-氨基酸，且所用到的酶容易被氧化而失活。

发明内容

针对现有技术中传统的熊去氧胆酸和D-氨基酸合成过程中存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种环境友好、收率高、成本低的同时制备熊去氧胆酸和D-氨基酸的方法，该方法以CDCA和α-酮酸为原料，利用7α-HSDH、DAADH、7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)以及辅酶NADP⁺等催化剂，巧妙地通过辅酶再生体系偶联了7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)催化鹅去氧胆酸(CDCA)脱氢氧化和D-氨基酸脱氢酶(DAADH)催化α-酮酸羰基氨化过程，并且设计了较完美的分离纯化过程，以回收重复利用酶催化剂，同时获得高纯度的熊去氧胆酸和D-氨基酸目标产物。相对现有的酶合成方法，可以大大降低辅酶的成本，在同一体系中合成两种产物，可以降低生产的分摊成本，且酶催化反应过程不需有机试剂，水相反应，条件温和，转化率高，是一种环保、绿色、高效的催化合成新技术。

本发明提供了一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度D-氨基酸的方法，该方法包括以下步骤：

1)将鹅去氧胆酸和α-酮酸置于含7α-HSDH和DAADH及NADP的溶液体系中进行酶催化反应，得到含7-KLCA和D-氨基酸的酶反应液；

2)将含7-KLCA和D-氨基酸的酶反应液采用超滤膜分离，膜内为浓缩的混合酶液，膜外透析液经过调解pH至3.0～6.0进行结晶，过滤分离，得到7-KLCA湿粉和滤液；