[发明专利]一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用

说明书

一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用，属于鲤鱼细胞培养技术领域。为了解决鲤鱼三倍体细胞生长需求的问题，本发明提供了一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，所述无血清培养基包括DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素，所述培养添加剂包括重组人胰岛素样生长因子‑1、重组人碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、纤粘连蛋白、非必需氨基酸和4‑羟乙基哌嗪乙磺酸。本发明能减少了细胞污染，简化提纯和鉴定各种细胞产物的程序，适用于鲤鱼三倍体细胞的培养。

技术领域

本发明涉及鲤鱼细胞培养技术领域，具体涉及一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基及其应用。

背景技术

细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。体外培养细胞在使用合成培养基时需要添加一些天然成分，其中最重要的是血清，血清所含成分复杂，不同批次血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差，需要大量验证工作；血清存在污染外源病毒和致病因子的风险，容易被病毒和支原体感染；含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，影响细胞生长和细胞某些功能的表达，对某些细胞的体外培养有去分化作用。

市面上出售的培养基的组成成分，建立在对不同细胞系生长的研究之上的。三倍体细胞相对于二倍体细胞，具有细胞体积大、营养需求量大的特点，实验人员曾用市面上的培养基对三倍体细胞进行培养，会出现细胞生长缓慢、贴壁率低、传代时间长等问题，不利于三倍体细胞的培养。目前并没有专门针对鲤鱼三倍体体细胞培养的专用培养基，不能完全满足三倍体体细胞的生长要求，对三倍体体细胞的培养效果总是不很理想。

发明内容

为了解决鲤鱼三倍体细胞生长需求的问题，本发明提供了一种适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，所述无血清培养基包括DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素，所述培养添加剂包括重组人胰岛素样生长因子-1、重组人碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白、纤粘连蛋白、非必需氨基酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

进一步地限定，所述无血清培养基由DMEM基础培养基、培养添加剂和抗生素组成，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.21-0.35μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.24-0.33μg、血小板源性生长因子0.20-0.27μg、牛血清白蛋白4.71-5.90mg、牛转铁蛋白6.30-7.51mg、纤粘连蛋白0.81-1.32mg、非必需氨基酸1.90-2.51mg和4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.303-2.402g，所述含量为各成分在每升无血清培养基中的含量。

优选地，所述培养添加剂中各成分及含量为：重组人胰岛素样生长因子-1为0.30μg、重组人碱性成纤维细胞生长因子0.30μg、血小板源性生长因子0.22μg、牛血清白蛋白5.3mg、牛转铁蛋白6.8mg、纤粘连蛋白1.0mg、非必需氨基酸2.2mg和4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.383g，所述含量为各成分在每升无血清培养基中的含量。

进一步地限定，所述抗生素为青霉素和链霉素，所述青霉素在每升无血清培养基中的终浓度为100U/mL，所述链霉素在每升无血清培养基中的终浓度为100U/mL。

本发明还提供了所述的适用于鲤鱼三倍体细胞生长的无血清培养基，在鲤鱼三倍体细胞培养中的应用。

所述鲤鱼三倍体细胞培养方法如下：

1)原代细胞的培养：采用组织块贴壁法对三倍体鲤鱼细胞进行原代细胞的培养；

2)传代细胞培养法：长满单层后进行传代培养，用胰蛋白酶消化液消化细胞系，弃掉消化液，加入完全培养液，将细胞吹散成单个后继续培养，细胞贴壁后换液去除死细胞，长满单层后继续传代培养；

3)无血清培养基培养：传代至鲤鱼三倍体细胞性状稳定，将细胞置于无血清培养基中培养。