[发明专利]一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用

说明书

本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，公开了一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用。抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对黄瓜花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括黄瓜花叶病毒的2b基因。所述的2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.19所示。本发明的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受黄瓜花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

技术领域

本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体地说，涉及一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。由于作物病毒病种类多，传播途径复杂，生产上没有免疫或高抗病毒病的品种，市场上又没有对病毒病特效的药剂，因而病毒病的防治非常困难。

烟草病毒病一直是制约我国烟叶生产的重要因素。目前生产上的烟草主栽品种对病毒病的抗性都不理想，烟草病毒病的防治主要依赖农业防治和化学防治。但生产中没有针对病毒病的特效药剂，通过杀灭传毒昆虫来防治烟草病毒病的效果很差，而且农药的大量应用也不符合烟叶生产可持续发展的要求。利用弱毒株系保护植物免受强毒株系的侵染和危害(交叉保护)是防治病毒病非常有效的手段，在许多作物病毒病的防治中取得了成功。最近几年，交叉保护受到了越来越多的关注。交叉保护是指植株受弱毒株系侵染后，免受后继的病毒强毒株系侵染的现象，已经在许多作物病毒病的防治中取得了成功。而限制交叉保护广泛应用的关键因素是一是目前可用的弱毒株系种类不多，应用不方便，二是已发现的弱毒株系都是自然存在或人工诱变产生的，可能只在个别甚至是一个氨基酸位点发生了突变。这些弱毒株系或突变体在用于防治病毒病时有突变为强毒株系的风险。

黄瓜花叶病毒(CMV)是一种非常严重的病毒病害，病毒可以到达除生长点以外的任何部位。黄瓜花叶病毒是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。全世界所有烟草种植区均有该病毒的分布和危害。在农业生产中，黄瓜花叶病毒会对烟草、辣椒、马铃薯等茄科作物造成严重的损失。因此，急需能够起到有效交叉保护作用的稳定的弱毒疫苗来防治黄瓜花叶病毒。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用。本发明的抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗作用稳定，可以起到有效的交叉保护作用，显著减轻植物受黄瓜花叶病毒强毒株系感染后的伤害，延迟植物发病，大大减少损失。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种抗黄瓜花叶病毒的弱毒疫苗，弱毒疫苗以TVBMV弱毒突变体为基础，TVBMV弱毒突变体中嵌入了可诱导对黄瓜花叶病毒产生交叉保护的有效基因片段，所述的有效基因片段包括黄瓜花叶病毒的2b基因。

本发明以自主构建的烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)突变体为基础，该突变体在接种植物后不会引起可见症状，不会由蚜虫传播，使用安全。通过RT-PCR、酶切连接技术将黄瓜花叶病毒(CMV)的不同基因片段连入TVBMV突变体获得嵌合体病毒，也就是弱毒疫苗。然后将弱毒疫苗接种植物，接种15天后再用黄瓜花叶病毒(CMV)强毒株系侵染植物。结果意外地发现CMV的2b基因片段可延迟烟草发病，减轻植株感染病毒病后的损失。

进一步的方案，所述的2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.19所示。

进一步的方案，所述的TVBMV弱毒突变体包括烟草脉带花叶病毒HN39的基因组，基因组的5’末端连接有35S启动子；且基因组的HC-Pro氨基酸序列中含有突变，至少第52位的精氨酸突变为谷氨酸。