[发明专利]基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法

说明书

本发明公开了基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法。本发明提供了一种激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法，是基于CRISPR‑on的SAM系统建立激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法。所述SAM系统包括靶向Pdx1基因转录起始点上游‑400至+1bp位置的sgRNA，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4。本发明应用CRISPR‑on技术，通过染色质重塑，能够高效地激活293T细胞的Pdx1表达。本研究将对基因诱导PSCs定向分化为β细胞以及胰腺的胚胎发育研究具有重要作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法。

背景技术

糖尿病的发病率正在逐年显著增加。2017年WHO报告显示，目前全球糖尿病的发病率约为8.5％，大约有4.22亿糖尿病患者。1型糖尿病是由于胰岛β细胞受到自身免疫反应攻击所导致的。当残存的胰岛β细胞数量少于胰岛细胞总数的10-20％就会表现出临床症状[Gillespie,K.M.Type 1diabetes:pathogenesis and prevention.CMAJ 175,165-170,doi:10.1503/cmaj.060244(2006).]。2型糖尿病是由于细胞增殖能力下降和细胞凋亡增加而导致β细胞功能异常和进行性细胞数量减少[Joost,H.G.Pathogenesis,riskassessment and prevention of type 2diabetes mellitus.Obes Facts 1,128-137,doi:10.1159/000137673(2008).]。目前，胰岛β细胞移植被认为是治疗糖尿病最有效的办法之一。然而，大规模胰岛β细胞移植的应用却受到细胞来源短缺和终生使用免疫抑制剂等限制[Atkinson,M.A.Eisenbarth,G.S.Type 1diabetes:new perspectives on diseasepathogenesis and treatment.Lancet 358,221-229,doi:10.1016/S0140-6736(01)05415-0(2001).]。多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)，具有自我更新和多向分化潜能。因此，PSCs成为糖尿病的细胞治疗的理想细胞来源。近年来，PSCs定向分化为胰岛β细胞和非胰岛β细胞转分化的研究取得了较大的进展[Miyazaki,S.,Yamato,E.Miyazaki,J.Regulated expression of pdx-1promotes invitro differentiation of insulin-producing cells from embryonic stemcells.Diabetes 53,1030-1037(2004).]。目前诱导细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法主要包括两类：一是采用调控胰岛β细胞发生特异性转录因子法；另一是生长因子和小分子化合物组合法。基因诱导方法主要是采用胰岛细胞发生过程中的关键性转录因子诱导细胞分化与转分化。Miyazaki等采用Tet off系统构建了诱导表达Pdx1的ES细胞系，结果显示Pdx1能够提高生长因子和小分子化合物法诱导ESCs向β细胞分化的效率，增强分化细胞相关基因的表达，如insulin 2、somatostatin、Kir6.2、glucokinase、neurogenin3、p48、Pax6、PC2和HNF6[Miyazaki,S.,Yamato,E.Miyazaki,J.Regulated expression of pdx-1promotesin vitro differentiation of insulin-producing cells from embryonic stemcells.Diabetes 53,1030-1037(2004).]。Kubo等的研究结果表明，过表达Pdx1和Ngn3能够显著上调内胚层细胞表达insulin和胰岛相关基因[Kubo,A.et al.Pdx1and Ngn3overexpression enhances pancreatic differentiation of mouse ES cell-derivedendoderm population.PLoS One 6,e24058,doi:10.1371/journal.pone.0024058(2011).]。表达Pdx1的腺病毒感染人皮肤角质细胞，能迅速激活胰腺发生相关的特异性转录因子，将细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。这些转分化细胞在葡萄糖刺激下具有合成和分泌胰岛素的功能[Mauda-Havakuk,M.et al.Ectopic PDX-1expression directlyreprograms human keratinocytes along pancreatic insulin-producing cellsfate.PLoS One 6,e26298,doi:10.1371/journal.pone.0026298(2011).]。Zhou等发现Pdx1，Ngn3和MafA在小鼠体内可将胰腺外分泌部细胞转化为胰岛β细胞。这些转化的细胞与内源性的胰岛β细胞非常相似，表达胰岛β细胞功能相关基因，能够分泌胰岛素，降低小鼠的血糖[Zhou,Q.,Brown,J.,Kanarek,A.,Rajagopal,J.Melton,D.A.In vivoreprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.Nature 455,627-632,doi:10.1038/nature07314(2008).]。Akinci等采用了同样的方法，观察了体外Pdx1，Ngn3和MafA对大鼠胰腺外分泌细胞系AR42j-B13的转分化作用。尽管转分化所获得的细胞表达胰岛素，降低糖尿病小鼠的血糖水平；但细胞内源性的Pdx1，Ngn3和MafA没有被激活，且不表达胰岛β细胞功能相关的一些基因。因此，这些细胞的转分化是不完全的[Akinci,E.,Banga,A.,Greder,L.V.,Dutton,J.R.Slack,J.M.Reprogramming ofpancreatic exocrine cells towards a beta(beta)cell character using Pdx1,Ngn3and MafA.Biochem J442,539-550,doi:10.1042/BJ20111678(2012).]。基因诱导分化的方法具有特异性强，操作相对容易，成本较低。然而，目前外源基因过表达的方法很难激活内源性相关基因的表达，因此，分化的细胞不具有成熟的生理功能。胚胎发育中各谱系的细胞分化是受谱系特异性转录因子精确调控，最终分化为各胚层的终末分化细胞。与此同时，细胞分化过程中各种转录因子的活化是受表观遗传学各种调控机制控制的。表观遗传学因素与各种转录因子相互协调作用，形成适合于特定谱系分化的微环境，才能有效保证机体各种细胞的正常分化。表观遗传学在细胞功能中的重要作用可从细胞重编程过程中得到佐证。由成纤维细胞重编程至iPSCs的过程，影响重编程效率的一个重要因素就是表观遗传学障碍。Huangfu等的研究显示，DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够显著提高细胞重编程的效率。尤其是组蛋白去乙酰化酶抑制剂valproic acid(VPA)能够将重编程效率提高100倍[Huangfu,D.et al.Induction of pluripotent stem cells by definedfactors is greatly improved by small-molecule compounds.Nat Biotechnol26,795-797,doi:10.1038/nbt1418(2008).]。近期，Ding小组通过CRISPR(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)技术重置染色质Oct4和Sox2位点的表观遗传状态，激活内源性Oct4和Sox2的表达，成功地重编程成纤维细胞至iPSCs[Liu,P.,Chen,M.,Liu,Y.,Qi,L.S.Ding,S.CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the EndogenousOct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency.Cell Stem Cell 22,252-261e254,doi:10.1016/j.stem.2017.12.001(2018).]，这进一步显示了表观遗传在细胞功能中的重要作用。