[发明专利]基于染色质重塑激活内源性Pdx1基因表达的方法

权利要求书

1.一种激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法，是基于CRISPR-on的SAM系统建立激活靶细胞中内源性Pdx1基因表达的方法；

所述SAM系统包括靶向Pdx1基因转录起始点上游-400至+1 bp位置的sgRNA；所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：使所述靶细胞表达dCAS-VP64融合蛋白、MS2-P65-HSF1融合蛋白和所述sgRNA，从而激活所述靶细胞中内源性Pdx1基因表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）包装能够表达所述dCAS-VP64融合蛋白的重组慢病毒A；包装能够表达所述MS2-P65-HSF1融合蛋白的重组慢病毒B；然后将所述重组慢病毒A和所述重组慢病毒B一起感染所述靶细胞，得到阳性细胞系；

（2）向步骤（1）所得阳性细胞系中导入能够表达所述sgRNA的载体，进而实现激活所述靶细胞中内源性Pdx1基因表达。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，包装所述重组慢病毒A时，采用的目的质粒是lenti dCAS-VP64_Blast载体；包装所述重组慢病毒B时，采用的目的质粒是MS2-P65-HSF1_Hygro 载体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，包装所述重组慢病毒A和所述重组慢病毒B时，采用的包装细胞均为293T细胞。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，能够表达所述sgRNA的载体为载体A和载体B；

所述载体A为将通过BsmB I酶切位点向lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone中插入SEQID No.3所示DNA片段后得到的重组载体；所述载体B为将通过BsmB I酶切位点向lentisgRNA(MS2)_zeo backbone中插入SEQ ID No.4所示DNA片段后得到的重组载体。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述靶细胞为293T细胞或多能干细胞。

8.一种制备内源性Pdx1基因表达被激活的细胞的方法，包括如下步骤：利用权利要求1-7中任一所述的方法制备得到内源性Pdx1基因表达被激活的细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述细胞为293T细胞或多能干细胞。

10.sgRNA，为靶向Pdx1基因转录起始点上游-400至+1 bp位置的sgRNA；所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

11.能够表达权利要求10所述sgRNA的载体。

12.根据权利要求11所述的载体，其特征在于：所述载体由载体A和载体B组成；

所述载体A为将通过BsmB I酶切位点向lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone中插入SEQID No.3所示DNA片段后得到的重组载体；所述载体B为将通过BsmB I酶切位点向lentisgRNA(MS2)_zeo backbone中插入SEQ ID No.4所示DNA片段后得到的重组载体。

13.成套载体，由权利要求11或12所述的载体、lenti dCAS-VP64_Blast载体、MS2-P65-HSF1_Hygro 载体组成。

14.权利要求1-7中任一所述的方法在诱导多能干细胞定向分化为胰岛β细胞中的应用。

15.权利要求1-7中任一所述的方法在促进胰腺胚胎发育中的应用。