[发明专利]一种脑微细血管分离提纯方法

说明书

本发明公开了一种脑微细血管分离提纯方法，包括以下步骤：(1)取小鼠新鲜全脑组织，经Dounce匀浆器上下研磨12‑15次制备组织匀浆液；(2)将组织匀浆液经无菌玻璃磁珠和70μm尼龙细胞过滤器双重过滤，得到脑血管和微细血管组织。通过本发明的方法不仅可以有效提高分离出脑微细血管的完整度、数量和纯度，而且不破坏脑微细血管内各靶标蛋白的含量。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种脑微细血管分离提纯方法。

背景技术

阿尔兹海默病(AD)，即老年性痴呆，是严重影响公众生活质量的一种进行性发展的神经退行性病变。阿尔兹海默病其特征性病理改变为脑组织退行性变及老化造成小动脉、软脑膜和大脑皮层的毛细血管通透性改变,促使血清中淀粉样蛋白-β蛋白沉积在脑组织中与血管壁上，引发脑淀粉样血管病(CAA)。近年来血管因素在阿尔兹海默病的发生、发展中受到广泛关注。目前，阿尔茨海默病其病因及发病机制尚未阐明，导致至今没有获批的治疗方法，其主要原因是无法获取完整的足量脑微细血管且不破坏血管内淀粉样蛋白-β蛋白的含量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种脑微细血管分离提纯方法。该方法采用物理手段，可以有效提高分离出脑微细血管的完整度、数量和纯度，而且不破坏脑微细血管内各靶标蛋白的含量。

基于上述目的，本发明提供了一种脑微细血管分离提纯方法，其特征在于，包括：利用杜恩斯匀浆器研磨小鼠脑组织，制备小鼠脑组织匀浆液；小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织。所述小鼠脑组织为小鼠的新鲜全脑组织。所述利用杜恩斯匀浆器研磨小鼠脑组织，制备小鼠脑组织匀浆液中还包括：所述小鼠脑组织经杜恩斯匀浆器缓慢研磨12-15次获取小鼠脑组织匀浆液，且避免产生气泡。所述利用杜恩斯匀浆器研磨小鼠脑组织，制备小鼠脑组织匀浆液中还包括：所述小鼠脑组织匀浆液离心后，用4℃的含17％葡聚糖的20毫摩尔HEPES-DMEM重悬组织沉淀，4℃条件下10000g离心30分钟，去除上清液和脂肪层，不要触碰到含有脑血管和微血管的沉淀物。所述含有脑血管和微血管的沉淀物用4℃的含10％胎牛血清的20毫摩尔HEPES-DMEM重悬，获得组织悬液。所述小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞过滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织中还包括：将高压灭菌的无菌磁珠置于细胞过滤器中，无菌磁珠填充满细胞过滤器，使所述组织悬液与无菌磁珠接触。所述小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞过滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织中还包括：将所述无菌磁珠全部倒入组织培养皿中，向组织培养皿中加入所述含10％胎牛血清的20毫摩尔HEPES-DMEM，轻摇所述细胞过滤器和所述组织培养皿。所述小鼠脑组织匀浆液经无菌磁珠和细胞过滤器过滤，得到纯化的脑血管和微血管组织中还包括：重复所述向组织培养皿中加入含10％胎牛血清的20毫摩尔HEPES-DMEM，轻摇所述细胞过滤器和所述培养皿至少三次。

本发明实施例的结果显示：本发明提供的脑微细血管分离提纯方法，不会损伤脑血管和微细血管完整性，保证脑血管和微细血管获取的量，同时确保脑微细血管具有较高的分离纯度。

附图说明

图1为匀浆12-15次和15次以上显微镜下观察的分离小鼠脑微细血管(10×)；a.匀浆12-15次；b.匀浆15次以上

图2为无菌玻璃磁珠粒过滤4次之后磁珠上残留成分(20×)；

图3为收集的脑组织悬液和分离提纯的脑微细血管内皮标记CD31的Westernblot结果；a.CD31 Western blot图像；b.CD31分析结果。

图4为收集不同脑组织获取脑微细血管沉淀物的量；a.新鲜大脑皮层+海马组织的脑血管和微血管组织提取物；b.新鲜半脑脑血管和微血管组织提取物；c.新鲜全脑脑血管和微血管组织提取物；d.冰冻全脑脑血管和微血管组织提取物。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。