[发明专利]一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒及其制备方法和使用方法

权利要求书

1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括荧光素标记的NGAL抗体溶液、碱性磷酸酶标记的NGAL抗体溶液、包被荧光素抗体的磁微粒悬浮液、NGAL校准品和发光底物溶液；

所述荧光素标记的NGAL抗体溶液是将NGAL抗体加入到含有荧光素的pH为7-9的Tris-HCl缓冲液反应制备而成；

所述碱性磷酸酶标记的NGAL抗体溶液由碱性磷酸酶与NGAL抗体通过交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯连接而成；

所述包被荧光素抗体的磁微粒悬浮液是将荧光素抗体与含有羧基活性基团的磁微粒混合反应而成；

所述NGAL校准品是将NGAL抗原溶解到校准品缓冲溶液中配制而成，所述校准品缓冲溶液是通过在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；

所述发光底物溶液是将发光底物溶解于含有Tris、氯化钠(NaCl)、亚硫酸钠(Na2SO3)和Proclin-300的底物中配制而成。

2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在：

所述荧光素标记的NGAL抗体溶液浓度为0.8-1.2μg/mL，pH为7-9；

所述碱性磷酸酶标记的NGAL抗体溶液浓度为0.5-0.8μg/ml，pH为7-9。

3.一种如权利要求1或2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备所述荧光素标记的NGAL抗体溶液：

(1-1)配制含有荧光素的pH为7-9的Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液中含有4-8wt％的聚乙二醇6000(PEG-6000)、0.7-0.9wt％的氯化钠、0.08-0.1wt％的叠氮钠、0.6wt％的ProClin-300、0.8-1wt％的牛血清白蛋白和20mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)；

(1-2)按照所述荧光素与所述NGAL抗体分子比为150:1的比例，将步骤(1-1)中pH为7-9缓冲液与NGAL抗体混合，充分混匀，室温静置反应；

(1-3)将步骤(1-2)中的反应液通过G-25凝胶柱分离未结合的荧光素，得到含荧光素标记的NGAL抗体溶液；

(2)制备所述碱性磷酸酶标记的NGAL抗体溶液：

(2-1)使用二甲基亚砜溶剂将NGAL抗体溶解，使溶解后的NGAL抗体浓度为30-60mg/mL，加入交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯混合均匀，置于室温反应2-3小时；取适量二甲基亚砜溶剂对NGAL抗体与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物进行稀释，使稀释后的二甲基亚砜溶剂和NGAL抗体与辛二酸二琥珀酰亚胺酯的连接物的体积比为1:10，并将得到混合溶液置于2-8℃下保存备用；

(2-2)按照碱性磷酸酶与步骤(2-1)中交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:2的量将浓度为1-2mg/mL的碱性磷酸酶缓冲液加入步骤(2-1)中的混合溶液并混合均匀，室温放置反应1.5h；

(2-3)将步骤(2-2)中的反应液通过G-25凝胶柱除盐，即得所述碱性磷酸酶标记的NGAL抗体溶液；

(3)制备所述包被荧光素抗体的磁微粒悬浮液：

(3-1)在偶联剂碳二亚胺的环境下，将含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体混合均匀，室温放置反应10-20h，磁分离，除上清液，即得到所述包被荧光素抗体的磁微粒悬浮液；

(4)制备所述NGAL校准品：

(4-1)配制校准品缓冲溶液：在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；

(4-2)用所述校准品缓冲溶液溶解NGAL抗原，即得所述NGAL校准品；

(5)制备所述发光底物溶液：

(5-1)取Tris 2g、氯化钠(NaCl)6g、亚硫酸钠(Na₂SO₃)0.005g和Proclin-300 0.5mL于烧杯中，加入600mL纯化水，充分搅拌混匀至溶解，调节pH至7.5；加200mL发光底物，用0.2μm滤器过滤，纯化水定容至1000mL，混匀即得所述发光底物溶液。