[发明专利]一种KIR2DL2 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒

说明书

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种KIR2DL2 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒，引物和探针的设计方法包括以下步骤：（1）运用PCR‑SSOP方法对DNA样本进行KIR基因分型，筛选出KIR2DL2阳性DNA；（2）将阳性DNA样本进行PCR扩增、电泳；（3）提取KIR2DL2特异性DNA条带，经割胶、纯化后与T载体连接，经转化、挑选菌群后抽取质粒测序；（4）测序结果与KIR/IPD数据库进行比对，证实其为特征性基因序列；（5）根据特征性KIR2DL2基因序列，运用引物设计软件，设计出引物和探针。使用设计出的引物和探针进行基因检测。该方法提高了PCR检测的特异性和准确率。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种KIR2DL2 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）是主要表达于NK细胞膜表面的一种跨膜糖蛋白，其与配体HLA分子相互作用，产生同种异源NK细胞，发挥GVL效应，在造血干细胞移植的预后方面产生重要作用。KIR位于人染色体19q13.4，含有2个（KIR2D）或3个（KIR3D）胞外Ig样结构域，分为抑制性KIR（inhibitory KIR, iKIR）及激活性KIR（activating KIR, aKIR）两类，iKIR 基因包括有异源反应活性功能的KIR2DL1、KIR 2DL2、KIR3DL1等，aKIR 基因包括KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DL2、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1等。KIR各基因之间DNA序列80-90%相同，目前对于引物设计，多在NCBI上寻找目的基因序列，或者对该基因进行全基因测序，进而根据基因序列通过引物设计软件，设计出引物后，进行blast；这些方法在设计KIR各基因引物时均存在一定的局限性，主要表现为效率低、特异性差、准确率低。

发明内容

为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种KIR2DL2 mRNA的荧光定量PCR检测方法及其检测试剂盒，以提高KIR2DL2的检测效率以及检测的特异性。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

荧光定量PCR检测KIR2DL2 mRNA的引物和探针，其序列为：

2DL2F：5’- AGAAACCTTCTCTCTCAGCCC -3’；

2DL2R：5’- GCCCTGCAGAGAACCTACA -3’；

荧光探针：5’- TCCTGCAGCTCCCGG -3’。

获取权利要求1所述的引物和探针的方法，包括以下步骤：

（1）抽提正常人DNA样本，运用PCR-SSOP方法进行KIR基因分型，筛选出KIR2DL2阳性的正常人DNA样本；

（2）将筛选出的DNA样本采用市售KIR2DL2序列特异性引物扩增板（购于One Lambda）进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳；

（3）提取KIR2DL2特异性条带中的PCR产物，经割胶、纯化后，与T载体进行连接，转化受体是TOP10感受态耐链霉素的大肠杆菌，挑选菌群后，抽取质粒，使用ABI 3730XL型测序仪进行测序；

（4）测序结果与KIR/IPD数据库进行比对，证实其为特征性KIR2DL2基因序列，测序获得的具体序列为：

5’-AGAAACCTTCTCTCTCAGCCCAGCCGGGCCCCACGGTTCTGGCAGGAGAGAGCGT

GACCTTGTCCTGCAGCTCCCGGAGCTCCTATGACATGTACCATCTATCCAGGGAGGGGG

AGGCCCATGAATGTAGGTTCTCTGCAGGGC-3’；