[发明专利]一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法

说明书

本发明公开了一种基于γ‑H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法。该检测方法包括下述步骤：(1)将与计数微珠混合后的待检测细胞与抗体、以及通透液和封闭液混合、孵育后使用流式细胞仪进行荧光检测；所述的抗体包括抗γ‑H2AX抗体、p53蛋白抗体、磷酸化组蛋白H3抗体和抗Cleaved PARP抗体；(2)结果分析：排除死亡细胞，并通过Cleaved‑PARP阳性排除凋亡细胞后，根据活细胞的γ‑H2AX的表达分析细胞毒性信息。该检测方法检测体外细胞遗传毒性的方法简便、快速、准确并且可以提供多种机制信息的体外遗传毒性检测方法。

技术领域

本发明属于遗传毒性检测领域，具体涉及一种基于γ-H2AX的生物标志物的遗传毒性检测方法。

背景技术

在不同DNA损伤中，DNA双链断裂是最为严重的一种，而DNA损伤又与化学品的遗传毒性密切相关。具有纺锤体毒性的化学品则可影响细胞纺锤丝的合成或者纺锤体的形成，从而导致细胞周期阻滞、细胞凋亡，严重时可导致细胞染色体组出现非整倍体变化。细胞染色体的非整倍体性可导致多种疾病，例如21三体综合征等，而癌症的形成也于细胞的非整倍体性有密切的相关性。检测化合物诱导细胞的DNA损伤和非整倍体变化成为评价化合物遗传毒性的重要标志物。

现阶段遗传毒性检测的常用体外试验主要包括细菌回复突变试验(Ames试验)、哺乳动物细胞染色体畸变试验、哺乳动物细胞微核试验和哺乳动物细胞彗星试验等。这些体外检测方法在药物等的遗传毒性安全评价方面发挥着重要作用，也是目前国内外现阶段主要使用的检测方法。但是，这些体外方法有很多局限性：(1)假阳性结果比例较高；(2)目前常用的用于体外遗传毒性检测的细胞系(如CHL、CHO-K1细胞系等)多为啮齿类动物来源的细胞，试验结果外推至人体试验的符合性较差(黄鹏程,周长慧,常艳.基于γ-H2AX生物标志物DNA遗传毒性检测方法的研究进展[J].中国新药杂志,2016(4):418-424.)(3)目前常用的遗传毒性试验使用的细胞株均缺乏p53基因，DNA损伤修复机制不完整(欧红梅,周长慧,涂宏刚,常艳.p53基因状态对体外微核试验结果影响的研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2015,29(01):170-173.)。现有药物等化学品的遗传毒性性评价常用遗传毒性体外实验和动物模型对评价结果尤其是在将结果外推于人类时造成较大的不确定性，可能造成化学品由于假阳性结果而终止继续研发。同时，常用的体外遗传毒性评价方法，均不能直接提供化合物诱导非整倍体效应的评价指标。针对目前常用体外遗传毒性评价方法的局限性，将人源化体外培养的细胞株应用于遗传毒性评价，并整合多种生物标志物检测DNA双链断裂剂和非整倍体诱导剂，有望建立一种良好体外遗传毒性评价方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中用于检测体外细胞遗传毒性的方法假阳性率高、灵敏度低以及检测指标少等缺陷，提供一种基于γ-H2AX的生物标志物的遗传毒性检测方法。该检测体外细胞遗传毒性的方法简便、快速、准确并且可以提供多种机制信息的体外遗传毒性检测方法。

影响γ-H2AX生物标志物DNA遗传毒性检测方法的假阳性率高的主要原因在于正常死亡细胞(即凋亡细胞)的存在(Maria Tsamou,Danyel G.J.Jennen,SandraM.H.Claessen,ChristinaMagkoufopoulou,Jos C.S.Kleinjans and Joost H.M.vanDelft.Performance of in vitroγH2AXassay in HepG2cells to predict in vivogenotoxicity[J].Mutagenesis,2012,27(6),645–652.)；而如何提高检测的特异性、降低假阳性率并保证检测的灵敏度一直是本领域内亟待解决的问题。发明人创造性地从PI细胞核单染、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸(Annexin V)以及半胱天冬酶3(Caspase-3)以及DNA修复酶PARP的切割底物Cleaved-PARP等众多细胞凋亡标志物中挑选Cleaved-PARP用于本发明以降低假阳性率，解决了本领域内的技术难题，促进了领域中遗传毒性的检测方法的发展。