[发明专利]一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法

权利要求书

1.一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法，其特征在于，所述的生物标志物遗传毒性检测方法包括下述步骤：

(1)将与计数微珠混合后的待检测细胞与抗体、以及通透液和封闭液混合、孵育后使用流式细胞仪进行荧光检测；所述的抗体包括抗γ-H2AX抗体和抗Cleaved-PARP抗体；

(2)结果分析：排除死亡细胞，并通过Cleaved-PARP阳性排除凋亡细胞后，根据活细胞的γ-H2AX的表达分析细胞毒性信息。

2.如权利要求1所述的生物标志物遗传毒性检测方法，其特征在于，所述的遗传毒性为化学物质的遗传毒性；和/或，步骤(1)中所述的待检测细胞为人成淋巴TK6细胞。

3.如权利要求1所述的生物标志物遗传毒性检测方法，其特征在于，所述的生物标志物遗传毒性检测方法中还将p53基因作为生物标志物；较佳地，步骤(1)中所述的抗体还包括抗p53蛋白抗体；

和/或，所述的生物标志物遗传毒性检测方法还将组蛋白H3作为生物标志物，将步骤(1)中所述的与计数微珠混合后的待检测细胞的一部分与抗组蛋白H3抗体、通透液和封闭液混合、孵育后使用流式细胞仪进行荧光检测。

4.如权利要求1所述的生物标志物遗传毒性检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的封闭液为1％牛白蛋白，所述的通透液为1×Perm/Wash buffer。

5.如权利要求1所述的生物标志物遗传毒性检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的待检测细胞经过下述处理后得到：①固定待检测细胞；②使用带有计数微珠的试剂对固定所得的待检测细胞进行洗脱，或者对固定所得的待检测细胞进行洗脱后再加入计数微珠；较佳地：

步骤①中用于所述固定的试剂为70％乙醇，优选-20℃预冷的70％乙醇，所述固定的时间为14～18小时，优选16小时；

和/或，步骤②中用于所述洗脱的试剂为PBS溶液，优选计数微珠浓度为(0.8～1.2)×10⁴个/mL的PBS溶液，更优选计数微珠浓度为1×10⁴个/mL的PBS溶液。

6.如权利要求1～5任一项所述的生物标志物遗传毒性检测方法，其特征在于，所述的生物标志物遗传毒性检测方法包括下述步骤：

(1)固定待检测细胞；

(2)使用带有计数微珠的试剂对固定所得的待检测细胞进行洗脱，或者对固定所得的待检测细胞进行洗脱后再加入计数微珠

(3)将步骤(2)处理过的待检测细胞分为两份，一份与抗γ-H2AX抗体、抗Cleaved PARP抗体和抗p53蛋白抗体，以及通透液和封闭液混合并孵育，另一份与组蛋白H3，以及通透液和封闭液混合并孵育；再使用流式细胞仪进行荧光检测；

(4)结果分析：排除死亡细胞，并通过Cleaved-PARP阳性排除凋亡细胞后，根据活细胞的γ-H2AX、p53蛋白、组蛋白H3的表达分析细胞毒性信息，γ-H2AX、p53蛋白表达阳性可提示致遗传毒性机制为断裂剂；组蛋白H3和p53蛋白表达阳性可提示致遗传毒性机制为非整倍体诱导剂；γ-H2AX、组蛋白H3和p53蛋白表达阴性提示没有致遗传毒性作用。

7.一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括抗Cleaved PARP抗体以及抗γ-H2AX抗体。

8.如权利要求7所述的生物标志物遗传毒性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括抗p53蛋白抗体和/或抗组蛋白H3抗体。

9.如权利要求7或8所述的生物标志物遗传毒性检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括PBS、计数微珠、封闭液和/或通透液；所述的封闭液优选1％牛白蛋白，所述的通透液优选1×Perm/Wash buffer。

10.Cleaved-PARP在基于γ-H2AX的生物标志物的遗传毒性检测方法中的应用。