[发明专利]一种有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体及其应用，其表达载体构建步骤为：一、以大肠杆菌K‑12为模板PCR扩增trpBA基因，纯化后连接到pCold I载体上，得到重组质粒trpBA‑pCold I，二、设计引物P_{敲除lacO‑F}/P_{敲除lacO‑R}，以trpBA‑pCold I质粒为模板进行全质粒PCR，产物经Dpn I处理后转化大肠杆菌，再进行质粒扩增、培养、测序，得到敲除lacO序列的新重组质粒，再对新重组质粒的cspA启动子进行随机突变并转化大肠杆菌经扩增、培养、测序、筛选得到有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体。该方法能够避免化学诱导剂的使用，不需要调整发酵温度，从而有效降低色氨酸合成酶的生产成本，且为进一步研究启动子对基因表达的影响提供了理论基础。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，涉及一种新型表达载体及其应用。

背景技术

L-色氨酸是人和动物体内的必需氨基酸，在医药、食品和饲料添加剂等方面具有广泛的用途。L-色氨酸是我国氨基酸生产中的4大“瓶颈”氨基酸之一。在大肠杆菌中，色氨酸合成酶是具有α₂β₂亚基结构的异四聚体，其α亚基、β亚基分别由trpA、trpB基因编码。该酶能以吲哚和L-丝氨酸为底物，酶促合成L-色氨酸。在色氨酸代谢工程育种中，色氨酸合成酶是影响色氨酸产率的3个重要限制酶之一。

现有研究一般将紧密连锁的trpB和trpA基因(简称trpBA)连接到pET系列原核表达载体，pET系列表达载体的启动子为lac强启动子，该启动子受大肠杆菌lac阻遏蛋白负调控，需要在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖诱导下表达目的蛋白。一方面，IPTG价格高昂，且有一定的毒性；另一方面，如果采用价格相对较低且安全的乳糖，也存在许多问题，因为乳糖可以被大肠杆菌以碳源的形式代谢，导致色氨酸合成酶的表达不稳定。

宝生公司的pCold系列表达载体是冷休克表达载体，该载体应用冷休克基因之一的cspA基因启动子设计而来，可以有效表达蛋白质。但其为了严谨调控蛋白质表达，在cspA启动子下游插入了lacO序列，因此在使用该载体表达外源蛋白时，需要降温并使用IPTG等化学诱导剂。为避免化学诱导剂的使用，本发明敲除了lacO序列，但菌体的生长受到抑制，且色氨酸合成酶的表达量急剧降低。这可能是因为cspA启动子是一种极强的启动子，在没有lacO序列调控的情况下，渗漏表达的过多色氨酸合成酶影响了菌体的正常代谢。因此，有必要对cspA启动子进行改造，找到一种既不影响菌体的正常代谢，又能有效表达色氨酸合成酶的启动子。

通过敲除pCold I载体的lacO序列并对其cspA启动子进行突变，本发明构建了一种不需要使用化学诱导剂，菌体生长完全不受影响，并能在16-37℃范围有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效表达色氨酸合成酶的新型的表达载体以及利用该表达载体在大肠杆菌中高效表达重组蛋白色氨酸合成酶的方法。

pCold I表达载体能够在低温条件下高效表达外源蛋白，但需要使用化学诱导剂和降温处理。通过敲除pCold I表达载体的lacO序列，并对其cspA启动子进行突变，得到了一种新型表达载体。转化此新型表达载体的大肠杆菌可以在无需任何诱导方式(包括使用化学诱导剂和改变温度等)且不影响菌体正常生长的情况下，高效表达有活性的色氨酸合成酶。

一种有效表达色氨酸合成酶的新型的表达载体的构建方法为：

一、trpBA-pCold I载体的构建

(1)根据GenBank提供的大肠杆菌K-12的trpBA基因序列设计引物F、R(序列见表1)，以大肠杆菌的基因组DNA为模板扩增trpBA基因，凝胶电泳条带约为2000bp，与色氨酸合成酶原基因大小一致；