[发明专利]一种有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体及其应用

权利要求书

1.一种有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体，其特征在于所述表达载体是将原表达载体pCold I的lacO序列进行了敲除，并在此基础上对其启动子cspA进行了随机突变，筛选得到距cspA启动子5’端47位的T碱基发生缺失的优良突变体，新型表达载体的启动子及5`非翻译区的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体的构建方法，其特征在于步骤为：

一、trpBA-pCold I载体的构建

(1)根据GenBank提供的大肠杆菌K-12的trpBA基因序列设计引物F、R，以大肠杆菌的基因组DNA为模板扩增trpBA基因，凝胶电泳条带约为2000bp，与色氨酸合成酶原基因大小一致；

(2)将PCR产物进行纯化，连接到pCold I载体上，得到重组质粒trpBA-pCold I，菌落PCR验证后送测序，测序结果表明色氨酸合成酶原基因成功插入至载体pCold I；

二、表达载体的构建

(1)根据pCold I载体lacO序列两端的序列设计引物P_敲除lacO-F/P_敲除lacO-R，以trpBA-pColdI质粒为模板进行全质粒PCR，将所得的PCR产物Dpn I处理后转化大肠杆菌DH5α后进行质粒扩增，涂布含有抗性的平板后37℃培养，挑取单菌落至含有抗性的液体LB培养基培养，提取质粒进行DNA测序，DNA测序结果表明成功敲除lacO序列，将缺失了lacO序列的重组质粒命名为trpBA-pCold I_缺失质粒；

(2)对trpBA-pCold I_缺失质粒的cspA启动子进行PCR介导的随机突变，得到一系列突变体，将所得突变体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，选取与只转化了trpBA-pCold I质粒的重组菌生长速度差不多，且具有色氨酸合成酶活性的突变体进行测序，结果筛选到仅在距cspA启动子5`端47位的T碱基发生缺失的理想突变体，将该突变体命名为trpBA-pCold I<sub>新型质粒</sub>，测序结果表明，包括5`非翻译区在内的其他位点无突变，trpBA-pCold I_新型质粒的cspA启动子及5`非翻译区序列如SEQ ID NO.1所示；

所述引物P_敲除lacO-F的序列(5’-3’)为gcttaatgcacatcacgcatatccagtgtagtaaggcaag；

所述引物P_敲除lacO-R的序列(5’-3’)为tgatgtgcattaagccacgcattgg；

所述引物F的序列(5’-3’)为atgcaccatcatcatcatcatatgacaacattacttaacccctatt；

所述引物R的序列(5’-3’)为tgcttttaagcagagattacctagttaactgcgcgtcgccgctttcat。

3.一种有效表达色氨酸合成酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤为：

(1)将权利要求1或2所述构建成功的有效表达色氨酸合成酶的新型表达载体转入大肠杆菌中，在37℃，过夜静置培养后，挑取单菌落于5mL加有卡那抗生素的LB培养基中，37℃进行培养；

(2)在上述培养按终OD_600nm为0.02时转接至含50mL加有卡那抗生素的LB培养基的250mL三角瓶中，200r/min，温度37℃，培养至OD_600nm为0.4至1.0时，37℃继续培养3-10小时。收集菌体，得到有效表达色氨酸合成酶的基因工程菌trpBA-pCold I_新型质粒。

所述大肠杆菌是以下任意一种：大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS。