[发明专利]一种抗D-二聚体单克隆抗体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种抗D‑二聚体单克隆抗体及其制备方法，属于生物技术领域。本发明首先通过杂交瘤细胞制备出抗D‑二聚体单克隆抗体，再对所得抗体的序列进行优化，在亲和力保持不变的前提下，抗D‑二聚体单克隆抗体的产量提高了54％，极大的降低了生产的成本。本发明方法与现有的杂交瘤细胞培养及小鼠腹水提取方法相比，不仅大幅提高了表达量、降低了生产成本，还能够有效的控制了产品批次之间的稳定性。

技术领域

本发明涉及一种抗D-二聚体单克隆抗体及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

D-二聚体是交联纤维蛋白经纤溶酶作用后的终末产物。在凝血过程中，凝血酶在水解纤维蛋白原后，即相继释放出纤维蛋白肽A(FPA)和肽B(FPB)，剰余部分为可溶性纤维蛋白単体(SFM)，在转行酰胺酶作用下，SFM转变为纤维蛋白，继而血液凝固，其过程是经过一系列交联反应后完成，此后形成的纤维蛋白性质稳定，一般不溶解，但可被纤溶酶所降解，交联纤维蛋白在纤溶酶降解过程中逐渐生成若干种多聚体，D-二聚体即是其特异的产物之一，其分子量为184000～202000Da。在病理状态下，凝血与纤溶的动态平衡遭到破坏，凝血倾向增强，从而纤维蛋白降解产物增加，导致D-二聚体含量増加。D-二聚体水平的增高，表明体内有纤维蛋白血栓形成和纤溶发生，所以临床上可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物。

D-二聚体的检测对多种疾病的诊断及治疗有重要的价值。尤其可在无症状的高危患者中对深静脉血栓进行早期筛选；与肺泡-动脉氧分压差联合检测可作为排除诊断肺栓塞的首选筛选试验。此外还可辅助诊断肝脏疾病；对脑梗死进行诊断及预后判断；鉴别恶性肿瘤。其他能够引起D-二聚体升高的因素还有：创伤性的骨折、严重感染、稳定性冠心病、重症感染、儿童过敏性紫癜急性期、脓毒血症、结节病等。

常用的D-二聚体检测方法主要有：ELISA法、胶乳凝集法和发色底物法。这检测方法都需要选用具有高度特异性和高亲和力的抗D-二聚体单克隆抗体为载体。抗D-二聚体单克隆抗体的品质直接影响试剂盒检验结果的准确性和可靠性。因此开发和制备特异性强、亲和力高的抗D-二聚体单克隆抗体是开发各类高品质D-二聚体检测试剂盒的核心所在。

目前，抗D-二聚体的制备方法通常是采用杂交瘤细胞表达或者通过抽取动物的腹水经过提取后获得，这种制备方法不仅生产工艺复杂而且成本高，且批次之间的稳定性较差，不利于抗D-二聚体抗体的产业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种高度特异性的抗D-二聚体单克隆抗体及其制备方法，为检测试剂盒的制作提供可靠的基础。

本发明首先提供了一种抗D-二聚体单克隆抗体，其轻链氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了表达所述抗D-二聚体单克隆抗体的重组CHO细胞株，是以pCHO1.0为表达载体，在中华仓鼠卵巢细胞中表达所述抗D-二聚体单克隆抗体。

本发明还提供了培养所述重组CHO细胞株制备抗D-二聚体单克隆抗体的方法，是将种子细胞按(1.0±0.4)×10⁶个/ml的接种密度用Dynamis(Gibco)培养基稀释至3L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L，设置搅拌转速为250～280r/min，pH设置为6.95±0.15，通过碳酸氢钠溶液和CO₂调节pH；溶解氧设置为40±20％；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至33.5±0.5℃；培养第14天收获；第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料培养基为Feed C Plus，补料体积为初始培养体积的4％。