[发明专利]一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物

权利要求书

1.一种胡桃属植物多态性微卫星位点扩增引物，其特征在于，所述引物的正向引物序列为F：TCCACCTAAGTGAGGGCTTG；反向引物序列为R：GAGTGGTGGTGGAGGATGAT。

2.一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，对待筛选的植物进行RNA提取，所述的RNA进行de novo测序后得到转录本序列，然后将每个转录本序列聚类分析结果最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到多态性微卫星位点目标引物；

所述的数据处理包括：

(1)将EST-SSR根据引物PCR扩增产物片段大小进行降序排列，并将未设计引物的EST-SSR数据删除；

(2)再根据碱基重复类型进行EST-SSR降序排列后，将碱基重复类型为单碱基重复且碱基重复次数小于18的EST-SSR删除；

(3)根据EST-SSR碱基重复单元总数进行降序排列，删除碱基重复单元总数小于60的序列；

(4)根据EST-SSR引物PCR扩增产物片段大小进行升序排列，删除扩增产物片段大小在140bp以下并且碱基重复单元总数小于20的引物序列；

(5)根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，删除碱基重复单元总数小于18的引物序列；

(6)然后根据碱基重复单元总数按照降序进行排列，再删除碱基重复类型为Pc的碱基序列；

(7)依次以引物PCR扩增产物大小和碱基重复单元总数对EST-SSR进行降序排列，保留总序列数目中的位于前50％的引物序列为初筛序列；

(8)在初筛序列中选取产物片段长度为142-280bp的引物；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度段均保证对应五对引物，通过PCR扩增筛选即得多态性EST-SSR引物。

3.根据权利要求2所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，对胡桃属植物的叶片、芽和/或果实进行RNA的提取，对所述的RNA进行de novo测序后得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到胡桃属多态性微卫星位点目标引物。

4.根据权利要求2所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，利用Illumina Hiseq对提取得到的RNA进行高通量测序后得到原始reads，原始reads经如下处理后得到clean reads；再对clean reads进行de novo组装，得到转录本序列；

(1)去除不确定碱基比例占总碱基数的5％以上的reads；

(2)去除质量值Q≤10的碱基数达整条序列20％以上的reads；

(3)去除含测序接头的reads。

5.根据权利要求4所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，使用Trinity对得到的clean reads进行de novo组装，得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes；

通过MISA脚本http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html对Unigenes进行微卫星位点识别。

6.根据权利要求2所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，其特征在于，所述的引物设计采用http://primer3.sourceforge.net/releases.php设计引物，然后进行设计得到的引物的多态性扩增；控制产物片段长度为142-280bp；按10bp为分组标准，产物片段长度是142-280bp的每个长度均保证对应五对引物；即得EST-SSR引物；

引物设计参数：核苷酸长度为18bp-23bp，扩增产物大小为142-280bp，最适退火温度为58℃，GC含量为50％-60％。

7.一种引物，其特征在于，所述的引物采用权利要求2-6任一权利要求所述的快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法筛选得到。