[发明专利]一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物

说明书

本发明公开了一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物，所述的方法可用于筛选多态性好、稳定性高的EST‑SSR分子标记引物，进而后续对该属植物进行群体遗传和适应进化方面的研究。本发明在胡桃属物种转录组数据分析过程中，设计开发的EST‑SSR多态性微卫星位点并从开发的33‑77对EST‑SSR引物中筛选出12‑39对多态性好且稳定性高的EST‑SSR引物，条带清晰、能100％扩增，可靠性强，只需常规PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳及毛细管测序仪即可完成对该分子标记的快速筛选。开发的双亲遗传且与基因功能相关的EST‑SSR分子标记，可作为胡桃属群体遗传多样性和适应进化研究的引物，可为进一步遗传图谱构建、基因定位及分子辅助育种等研究提供科学依据。

技术领域

本发明属于植物分子生物技术领域，涉及一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物。

背景技术

EST-SSR是基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记，与基因组SSR相比，EST-SSR具有在植物物种之间可转移性的优点。目前，EST-SSR被广泛应用于植物基因组学研究如遗传图谱构建、比较作图、遗传多样性评价、种质鉴定、系统发育与进化研究等方面。传统基因组SSR标记开发费时、费力、且成本较高，需要投入大量的人力物力。而基于转录组数据，通过搜索SSR的EST-SSR标记开发具有稳定性高、通用性好、成本低、开发简单快捷等特点而备受关注。因为一些转录组微卫星标记可以转移到一些相关分类中，他们可以被有效用于群体进化分析、群体遗传研究和比较定位中，EST-SSRs数据不仅可开发功能，RNA-seq对于罕见转录本、多样化拼接和细胞中基因表达水平都有潜在的恢复作用，此外，采用高通量测序的方法对胡桃属物种丰富的遗传资源进行EST-SSR分子标记的开发筛选及遗传多样性研究，有利于特异资源的挖掘、分子标记辅助育种提供技术指导，有助于理解植物进化与适应。另外，在转录组数据分析的基础上开发EST-SSR引物，从中筛选多态性高、稳定性好的标记，这对胡桃属物种种质资源的保护具有重要的意义。

在引物开发方面，虽然胡桃属物种已开展一些基于分子标记的遗传研究，但主要是采用SSR、RAPD、ISSR、AFLP标记技术进行遗传多样性和品种鉴别等方面的研究(陈少瑜等2006，2011)，尤其在GenBank中有关于泡核桃的基因组资源只有17条核苷酸序列和181个蛋白序列。在泡核桃基因组DNA中并未出现微卫星位点的资料记载，所有关于泡核桃的研究(Wang et al.2015；Gunn et al.2010)受到了可利用的多态性标记数目及不存在可利用的ESTs(expressed sequence tags)标签的限制。尤其是通过转录组测序，表达功能基因注释等技术，进行泡核桃特异EST-SSR引物的开发还很有限，目前国内外均未见文献报道。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明给出了一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法及引物，解决了现有技术中缺乏快速筛选胡桃属植物EST-SSR分子标记方法的问题。同时得到了引物，该引物的扩增稳定性和多态性良好。

为解决上述问题，本发明采取的技术方案为：

一种胡桃属植物多态性微卫星位点扩增引物，所述引物的正向引物序列为F：TCCACCTAAGTGAGGGCTTG；反向引物序列为R：GAGTGGTGGTGGAGGATGAT。

一种快速筛选多态性微卫星位点目标引物的方法，对待筛选的植物进行RNA提取，所述的RNA进行de novo测序后得到转录本序列，然后把每个转录本序列聚类分析结果中最长的一个转录本序列作为Unigenes，对得到的Unigenes进行微卫星位点识别后进行引物设计得到EST-SSR，对EST-SSR进行数据处理、PCR扩增筛选得到多态性微卫星位点目标引物；

所述的数据处理包括：

(1)将EST-SSR根据引物PCR扩增产物片段大小进行降序排列，并将未设计引物的EST-SSR数据删除；