[发明专利]一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法

说明书

本发明公开了一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：清洗吐沙的步骤、收集体腔液的步骤、超声破碎的步骤、离心过滤的步骤、酶解的步骤，得到方格星虫体腔液目标抗菌肽。本发明通过超声波技术、酶解相结合的集成技术，利用低超声波处理裂解获取其胞内蛋白质，提供一种温和高效的细胞破碎工艺，为后续大量制备该蛋白水解提取提供便利；然后将方格星虫体腔液通过蛋白酶进行酶解，通过控制酶解的时间、温度、加酶量，获取具有高抑菌性的抗菌肽。

技术领域

本发明涉及一种有效成分提取技术，尤其涉及一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法。

背景技术

抗菌肽是指存在于生物体内，能抵抗外界微生物侵害，消除体内突变细胞的1类小分子多肽。抗菌肽具有广谱抗菌特性，特别是对多重耐药菌具有杀伤作用。其拥有与抗生素不同作用机制，细菌不易对其产生耐药性；滥用抗生素导致的多重耐药菌问题已经成为威胁人类健康的全球性公共卫生问题，研发一种天然无污染、高效且安全的抗菌药物是一项重要的发展方向，对缓解多重耐药菌蔓延以及降低耐药菌感染导致的死亡具有重要意义。

方格星虫(Sipunculus nudus)俗称沙虫、光裸星虫、沙肠子，是一种海洋底栖无脊椎动物，久居滩涂一带沙泥底质的海域；一般盛产于广东湛江及北部湾的北海市等地。星虫肉质脆嫩，味道鲜美，营养丰富，富含蛋白质、脂肪和钙、磷、铁等多种营养成分，具有较高药用功效和食疗价值。据记载，沙虫性寒、味甘、咸，具有滋阴降火、清肺补虚及补肾养颜等功能，可治疗骨蒸潮热、阴虚盗汗、肺虚喘咳、胸闷痰多及妇女产后乳汁稀少等症，对治疗肝炎、肺痨咳嗽、神经衰弱与小儿脾虚等症均有效果。研究表明，星虫的体腔液中含有多肽、多糖等丰富的营养成分，具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等功效。

但目前星虫仅主要以鲜食和干制加工为主，而体腔液部分在食用过程中基本被丢弃，极易造成资源浪费。国内外对方格星虫的研究主要集中在形态解剖学特征、繁殖生物学及生理生化等方面。目前，尚未发现有关从星虫体腔液中提取抑菌物相关研究的报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法。

本发明的目的采用如下技术方案实现：一种方格星虫体腔液中抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：

清洗吐沙的步骤：挑选新鲜生命力旺盛的方格星虫，用除菌海水清洗后；将方格星虫喂养于淡盐水中，每隔1h换水喂养，待方格星虫吐尽泥沙；

收集体腔液的步骤：将吐尽泥沙的方格星虫取出，用无菌水冲洗，用滤纸吸收体表多余水分，持镊子夹住星虫前段，使之垂直于消毒离心管中，在虫体末端剪一小口，使体液自然流出，逐条收集；

超声破碎的步骤：将收集的体腔液进行超声破碎裂解；

离心过滤的步骤：再将超声处理后的体腔液离心，用醋酸纤维膜过滤除菌，放入-20℃冰箱保存，得到体腔液蛋白粗提物；

酶解的步骤：将体腔液蛋白粗提物分别采用蛋白酶酶解，进行酶解后，酶解液放入沸水中灭酶，将酶解液离心，收集上清液，冷冻干燥，得到方格星虫体腔液目标抗菌肽。

进一步地，在清洗吐沙的步骤中，所述淡盐水的质量浓度为24‰。

进一步地，在超声破碎的步骤中，所述超声破碎的条件为：超声波温度为20-30℃、超声波频率为37-53kHz、超声波功率60-100W、超声波时间1-3min。

进一步地，在离心过滤的步骤中，所述离心的条件为：在4℃、3000-6000r/min条件下离心10-30min。

进一步地，在离心过滤的步骤中，所述醋酸纤维膜的膜孔径为0.1-0.22μm。

进一步地，在酶解的步骤中，所述蛋白酶选自酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或两种以上的混合物。