[发明专利]海带配子体DNA溶液的制备方法及性别鉴定方法

说明书

本发明公开了一种海带配子体DNA溶液的制备方法及性别鉴定方法，步骤为：海带配子体中加入灭菌的去离子水，充分研磨，经过沸水浴后室温静置，将上清液转移到灭菌离心管中，利用雌性特异引物HFM4和雄性特异引物Msj68‑16‑3进行一轮双引物PCR扩增，用于快速准确地鉴定多个品种或者品系海带配子体性别及混淆情况。本发明提供了一种简捷快速、不需要使用任何分子试剂制备海带配子体DNA溶液的方法并开发了一个海带雌配子体特异标记，针对性强，扩增效率高，稳定性好；结合实验室已开发的海带雄配子体特异标记，建立了一种利用海带配子体DNA溶液进行性别鉴定的方法，可以检测出海带配子体性别并确认是否发生雌雄混杂现象。

技术领域

本发明属于海洋生物技术海藻分子遗传学领域，主要涉及一种可用于PCR扩增的海带配子体DNA溶液的制备方法，并涉及一种快速鉴定海带配子体性别的方法。

技术背景

海带（Saccharina japonica）属于褐藻门（Phaeophyta），褐藻纲（Phaeophyceae），海带目（Laminariales），海带科（Laminariaceae），海带属（Saccharina）；是中国重要的经济海藻，在医药、化工、食品等领域用途广泛。上世纪70年代建立了海带雌雄配子体分离和克隆技术，该项技术为海带种质资源的保护、开发及利用奠定了基础。

海带配子体克隆可长期保持其优良性状和纯度，是海带种质资源的最佳保存形式，也是海带杂交育种的材料。配子体克隆在保存过程中最大的问题是会发生雌雄混杂，原因一般包含三个方面：一是分离配子体时，某些品种或品系雌、雄配子体表型特征不明显，显微镜镜检有死角存在，导致雌雄难以区分；二是配子体克隆一般采用液相方式长期保存，更换培养液易造成配子体雌雄混杂；三是在配子体扩培工作中，因操作不当或扩培器皿消毒不完全造成雌雄混杂。海带配子体性别混杂既影响保种效率，又无法确保利用海带配子体克隆育苗获得的孢子体为所选亲本的后代，同时也给一些建立在海带配子体性别正确辨别基础上开展的分子遗传学研究带来难度。由于保存的海带配子体一般呈现为交织丝状体，利用显微镜观察很难确定配子体是否已经发生雌雄混杂；因此，亟需建立一种快速、准确、高效的鉴定海带配子体性别的方法。

随着分子生物技术的发展，特别是PCR技术和分子标记技术的日趋成熟，使得利用分子生物技术进行海带配子体性别鉴定的目标得以实现，并在实际工作中得到很好的应用。PCR技术是生物体外的特殊DNA复制技术，特点是特异性强、敏感性高、对起始材料质量要求低、操作简便快速、重复性好。利用PCR技术鉴定海带配子体性别需要获得海带配子体的DNA，传统的基因组DNA提取方法主要包括裂解法、试剂盒法及衍生出的一系列改良方法。这些方法在准备阶段要配制各种试剂及缓冲液，样品也需要进行相应的预处理，而后还要经过抽提、沉淀、纯化等多步操作，实验步骤繁琐，费人力、财力；实验过程中使用的试剂一般都具有毒性，会对实验室环境和实验人员造成负面影响。

发明内容

本发明旨在提供一种海带配子体DNA溶液的制备方法及性别鉴定方法，所要解决的技术问题是：第一、提供一种简捷快速并且不需要使用任何分子试剂获得可用于PCR扩增的海带配子体DNA溶液的制备方法，用于海带配子体的性别鉴定和一些常规的分子生物学实验；第二、建立一种海带配子体的双引物PCR扩增的性别鉴定方法，用于快速检测出海带配子体性别及是否发生雌雄混杂。

本发明的技术方案如下：

一种海带配子体DNA溶液的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：海带配子体中加入灭菌的去离子水，充分研磨，经过沸水浴后室温静置，将上清液转移到灭菌离心管中，获得的上清液即为可用于PCR扩增的海带配子体DNA溶液。

优选地：取鲜重质量1mg~30mg的海带配子体于1.5 mL灭菌离心管中，加入500μL灭菌的去离子水，充分研磨，沸水浴5~40分钟，室温静置沉淀20分钟以上，将上清液转移到灭菌离心管中，获得的上清液即为可用于PCR扩增的海带配子体DNA溶液。