[发明专利]硝酸盐同化巨大芽孢杆菌的特异性片段及其应用

说明书

一种硝酸盐同化巨大芽孢杆菌的特异性片段及其应用，具体如Seq ID No.1～No.3所示，该巨大芽孢杆菌具有同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因，可利用生物酶法改良次生盐渍化土壤，具有效率快，对环境友好的特点。对硝酸盐同化巨大芽孢杆菌进行全基因组测序并经GenBank数据库全基因序列平行比对，最终获得所述特异性序列片段。通过本发明所述的特异性片段可快速准确的从环境中检出该巨大芽孢杆菌，并根据所述特异性片段制备相关工程菌。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种硝酸盐同化巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的特异性片段及其应用。

背景技术

由于设施农业的发展，及其在我国蔬菜和其他重要经济作物反季节和跨地区种植中的重要作用，设施农业在我国得以大面积推广应用。但是，由于缺乏匹配的设施农业土水肥管理措施，加上设施栽培长期处于高集约化、高复种指数、高肥料施用量，导致土壤此生盐渍化。

硝酸盐积累是土壤次生盐渍化的主要特征之一，由于其大量化肥的施入，特别是氮肥，致使土壤次生盐渍化问题严重突出，土壤中大量的硝态氮给环境和人们的身体健康造成严重威胁。

在菌剂施用过程中，需要有效跟踪硝酸盐同化巨大芽孢杆菌在土壤中的存活及迁移情况，以获得更好的菌剂施用效果；同时，为了解世面商家是否非法从本发明菌剂产品中分离获取该巨大芽孢杆菌，需要一种可快速、特异性鉴定该巨大芽孢杆菌的方法。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种硝酸盐同化巨大芽孢杆菌的特异性片段及其应用，本发明提及的巨大芽孢杆菌具有同化硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因，可利用生物酶法改良次生盐渍化土壤，具有效率快，对环境友好的特点。通过本发明所述的特异性片段可快速准确的从环境中检出该巨大芽孢杆菌，并根据所述特异性片段制备相关工程菌。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种硝酸盐同化巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的特异性片段，如Seq ID No.1～No.3所示。

所述的硝酸盐同化巨大芽孢杆菌，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏标号为CGMCC No.4698，保藏日期为2011年3月21日。

所述的保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学微生物研究所。

所述的硝酸盐同化巨大芽孢杆菌，分离自次生盐渍化设施大棚土壤。

本发明涉及上述特异性片段的实现方法，通过对硝酸盐同化巨大芽孢杆菌进行全基因组测序获得相应全基因组序列，将该菌全基因组序列与GenBank数据库中全基因进行对比，获得具有较高相似性的7株参考菌；将本发明巨大芽孢杆菌基因组全基因组序列与7株参考菌的基因序列进行比对，查找到该菌特有的序列，获得该菌种的特有序列(SEQ IDNO.1～NO.3)，最终获得所述特异性序列片段。

所述的全基因组测序是指：将冷冻保藏下硝酸盐同化巨大芽孢杆菌放入LB培养基培养24h，提取本发明巨大芽孢杆菌总DNA，通过采用三代测序技术，对细菌基因组进行测序、拼接、组装，获得完整细菌基因信息。对其进行功能基因注释,绘制基因组完成图。该巨大芽孢杆菌全基因组序列已上传NCBI网站，获得GenBank数据库注册号AHTF00000000。。

所述的7株参考菌包括：Bacillus megaterium NBRC 15308,Bacillusmegaterium DSM319,Bacillus megaterium QM B1551,Bacillus sp.IHB B 7164,Bacillus megaterium strain Q3,Bacillus megaterium WSH-002,Bacillus megateriumstrain JX285