[发明专利]硝酸盐同化巨大芽孢杆菌的特异性片段及其应用

权利要求书

1.一种硝酸盐同化巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的特异性片段，其特征在于，如Seq ID No.1～No.3所示；

所述的硝酸盐同化巨大芽孢杆菌，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏标号为CGMCC No.4698，保藏日期为2011年3月21日。

2.一种实现如权利要求1所述特异性片段的方法，其特征在于，通过对硝酸盐同化巨大芽孢杆菌进行全基因组测序获得相应全基因组序列，将该菌全基因组序列与GenBank数据库中全基因进行对比，获得具有较高相似性的7株参考菌；进而将所述全基因组序列与7株参考菌的基因序列进行比对，查找到该菌特有的序列，获得该菌种的特有序列，即SEQ IDNO.1～NO.3作为所述特异性序列片段。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的平行比对是指：通过BLAST软件将全基因组序列与NCBI数据库进行对比，获得具有较高相似性的同种菌株7株，然后将该巨大芽孢杆菌基因组全序列与参考菌的基因序列进行比对，查找到该菌特有的序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的参考菌的基因序列包括：含有硝酸盐同化巨大芽孢杆菌的设施土壤总DNA(CK-N)，硝酸盐同化巨大芽孢杆菌(N)、一株巨大芽孢杆菌(C1)、两株枯草芽孢杆菌(C2、C3)和两株胶体芽孢杆菌(C4、C5)。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征是，将比对的片段与NCBI数据库进行二次比对，对相似性较高的序列进行修剪，获得该菌种的特有序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的修建是指：针对对相似性较高的序列设计引物，获得三对引物片段，通过提取设施土壤(CK-S)总DNA和参考菌的基因序列进行PCR扩增，反向验证，获得相应扩增条带，并对三条特异性片段测序。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的引物片段包括：

第一上游引物，如Seq ID No.4所示，具体为f:5'cggatgtgagattaccagat 3'

第一下游引物，如Seq ID No.5所示，具体为r:5'agttaccgaggaggagtttt 3'

第二上游引物，如Seq ID No.6所示，具体为f:5'taggtaagcatacgaggaaa 3'

第二下游引物，如Seq ID No.7所示，具体为r:5'attactttttaaccctatgtatctt 3'

第三上游引物，如Seq ID No.8所示，具体为f:5'gtaatgggagattgtcatataggt 3'

第三下游引物，如Seq ID No.9所示，具体为r:5'cacagtggaccgcagga 3'。

8.一种基于上述任一权利要求所述特异性片段的应用，其特征在于，包括：①将其用于快速鉴定待测样品中的硝酸盐同化巨大芽孢杆菌以及②根据本菌株特异性片段制备相关工程菌株。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述的鉴定是指：通过特异性扩增得到巨大芽孢杆菌DNA分子鉴定的所述特异性片段。