[发明专利]一种提高基因突变检测灵敏度的方法

说明书

本发明涉及基因突变检测技术，具体涉及一种提高基因突变检测灵敏度的方法，包括以下几个步骤：S1、靶向DNA序列的PCR扩增；S2、PCR产物的纯化；S3、突变型特异性引物的延伸；S4、突变型基因DNA片段的杂交和富集。与传统的用作基因突变检测的ASPE技术不同，本发明的突变型特异性引物的延伸反应体系中，只加入突变型的前向引物和未标记的dNTPs；并且在突变型基因DNA片段的杂交后，通过核酸的变性和复性过程，而富集突变型基因DNA片段。该方法除去测序体系中占有主要部分的野生型基因DNA片段，富集了突变型基因DNA片段，显著的提高Sanger和NGS测序的灵敏度，理论上的提高能够达到100倍的数量级。本发明既可以富集单个的突变基因位点，又可以同时富集多个突变基因位点。

技术领域

本发明涉及基因突变检测技术，具体涉及一种提高基因突变检测灵敏度的方法。

背景技术

癌症有许多原因，但最终所有这些原因都对一类称为癌症基因或原癌基因的特殊基因起作用。癌基因通常执行基本的细胞功能，与调节细胞分裂有关。然而，原癌基因也可转变为致癌基因。原癌基因可以转变成其致癌(基因)状态的主要方式之一是通过基因突变。自发或环境诱发的突变发生在单个细胞的原癌基因中，然后经历多个细胞分裂形成肿瘤。

在癌症患者中，凋亡和坏死的肿瘤细胞释放他们的DNA内容到血液里，这通常称为循环肿瘤DNA(ctDNA)。液态活检技术可以从人体血浆中获得ctDNA，使用DNA测序或分子基因分型检测以鉴定和定量测量ctDNA携带体细胞基因突变的分子，对ctDNA基因突变的检测有着重要的作用。特定的基因突变可能表明某些类型肿瘤的存在，从而减少了对侵入性的组织活检的需求。定量监测ctDNA中的基因突变可以提供有关肿瘤患者在治疗期间的肿瘤负载的信息。此外，根据特定基因的突变情况，为肿瘤患者提供治疗方案，如直肠癌患者，KRAS基因的突变预示该患者对抗表皮生长因子受体单克隆抗体治疗效果很差。

目前ctDNA基因突变的分析方法包括下一代靶向测序(Next GenerationSequencing,NGS)和荧光探针的ddPCR。无论采用何种方法，对ctDNA基因突变的检测均存在挑战。血液中的DNA高度分裂成低分子量的DNA，平均小于200bp。ctDNA与正常DNA混杂在一起，因而，肿瘤DNA被来自正常细胞的DNA严重稀释，其含量可能低至0.01％。更为严重的是，每个突变等位基因在数目上明显的不敌几乎相同的野生型等位基因，数量比超过1比10,000。过多的野生型基因易导致假阳性的出现，并且使低含量的突变信号与噪音无法区分。下一代靶向测序的灵敏度大约是0.1％，对于低于0.1％的基因突变NGS则不能准确的检测出。因此，需要一种新的技术，能够尽可能的把含量丰富的野生型等位基因从ctDNA或循环的无细胞DNA(cfDNA)中分离出来，从而富集和提高突变基因的含量，便于NGS准确的测序。

发明内容

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种提高基因突变检测灵敏度的方法。

ctDNA含量偏低和突变型基因被大量野生型基因所遮蔽是影响基因突变检测灵敏度的主要因素。ctDNA含量的高低取决于肿瘤的负载和患者的治疗情况。在同一个反应体系中分离出野生型基因，从而富集突变型基因，有利于NGS的准确测序。利用PCR技术对靶向DNA序列进行放大扩增，这样野生型和突变型基因DNA序列均得到信号的扩增。PCR产物纯化后，再进行第二次的PCR的扩增。但这次的扩增仅针对于突变型基因，利用突变型的引物来进行。只有该引物3′末端碱基与基因突变的SNP位点完全碱基配对后，引物才能与模板结合和延伸。同时，突变型引物的5′末端有用于杂交用的Tag片段序列或者生物素。羧基磁珠、DNA芯片或其它的固态物质的表面均有抗Tag的序列或者链霉亲和素。利用Tag和抗Tag的碱基配对作用或者链霉亲和素与生物素的天然亲和力作用，把扩增后的突变型与野生型的基因DNA片段分开，从而达到富集突变型基因DNA片段的作用。该富集的效率可达到几千倍。

该方法有以下几个步骤：