[发明专利]一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，属于生物安全技术领域；所述的RPA引物基于小麦全蚀病菌β‑tubilin基因设计，RPA引物序列如SEQ ID No：1和2所示；所述的PRA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，其序列大小为45bp‑54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3‑Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。本发明还提供含有所述的RPA引物和探针的试剂盒。本发明进一步提供基于所述的RPA引物和探针建立的RPA检测方法，首次将RPA技术应用到土壤中小麦全蚀病菌的分子检测，兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为小麦全蚀病的早期诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法。

技术领域

本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

小麦全蚀病是由禾顶囊壳(Gauemannomyces graminic)引起的土传真菌病害，是小麦根部重要的病害之一。小麦全蚀病菌的危害部位主要是根部和茎基部15cm处，在小麦苗期到成株期均能致病，引起小麦植株矮小、干枯和白穗等症状。小麦全蚀病菌主要以菌丝体的形式在土壤及病残体中越冬越夏，其蔓延速度较快，只需几年即可扩散传染整块田地。因此，快速准确检测麦田土壤中小麦全蚀病菌，对小麦全蚀病的早期诊断、预测预报和综合防治具有重要意义。

目前，小麦全蚀病菌分子检测方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)、限制性片段长度多态性DNA标记(RFLP)和实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)。PCR和Real-time PCR检测灵敏度高，且可实现对该病菌的定量检测，但该技术对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高。因此，继续开发对小麦全蚀病菌高效、精确、对仪器设备要求低的检测技术具有重要的实践价值。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种新兴的恒温扩增技术，在37℃-42℃恒温条件下20min即可完成反应。RPA反应主要有三个过程：重组酶与RPA引物结合形成核蛋白微丝，向模板DNA移动，并将引物与模板DNA序列进行比对；引物与模板DNA发生碱基互补配对时，核蛋白微丝与模板DNA发生重组反应，并在单链结合蛋白的作用下，模板DNA解链；在DNA聚合酶的作用下，进行RPA扩增反应。结合侧向流层析试技术，可在10min内完成RPA扩增产物的检测，即利用RPA技术可在30min内完成对目标生物的可视化检测。目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在小麦全蚀病菌检测方面的报道。

发明内容

1、要解决的问题

针对小麦全蚀病菌尚无有效进行RPA技术检测的问题，本发明提供一种用于检测土壤小麦全蚀病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，为土壤中小麦全蚀病菌的现场检测和早期诊断提供新方法。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的RPA引物和RPA探针，

所述的RPA引物基于小麦全蚀病菌β-tubilin基因设计，

所述的RPA引物的上游引物如SEQ ID No：1所示，

所述的RPA引物的下游引物如SEQ ID No：2所示；

所述的PRA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，

所述的RPA探针的序列大小为45bp-54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。