[发明专利]一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的RPA引物和RPA探针，其特征在于：

所述的RPA引物基于小麦全蚀病菌β-tubilin基因设计，

所述的RPA引物的上游引物如SEQ ID No：1所示，

所述的RPA引物的下游引物如SEQ ID No：2所示，且其5’端用Biotin修饰；

所述的RPA探针如SEQ ID No：3所示，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在所述的RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。

2.一种含有权利要求1所述的RPA引物和RPA探针用于检测土壤中小麦全蚀病菌的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括RPA反应管、阳性对照模板、阴性对照模板中的至少一种。

4.一种用于检测土壤中小麦全蚀病菌的检测方法，其特征在于：

包括以下步骤：

（1）提取样品中的DNA；

（2）以步骤（1）提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；

（3）分析RPA扩增产物。

5.根据权利要求4所述的用于检测土壤中小麦全蚀病菌的检测方法，其特征在于：所述的RPA引物和RPA探针的检出限为10pg/μL。

6.根据权利要求4所述的用于检测土壤中小麦全蚀病菌的检测方法，其特征在于：步骤（2）中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：

待检测DNA模板 1.0μL

10μmol/L 权利要求1所述的RPA引物的上游引物 2.1μL

10μmol/L 权利要求1所述的RPA引物的下游引物 2.1μL

10μmol/L 权利要求1所述的RPA探针 0.6μL

反应缓冲液 29.5μL

RPA冻干粉 5.0mg

280mmol/L醋酸镁 2.5μL

ddH₂O 补足至50μL。

7.根据权利要求4所述的用于检测土壤中小麦全蚀病菌的检测方法，其特征在于：步骤（2）中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-45℃下反应20分钟，随后冰上终止反应。

8.根据权利要求4-7任意一项所述的用于检测土壤中小麦全蚀病菌的检测方法，其特征在于：步骤（3）中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有小麦全蚀病菌，若试纸条的仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有小麦全蚀病菌。