[发明专利]一种人工毛乳头样细胞的获取方法

说明书

本发明公开了一种人工毛乳头(dermal papilla,DP)样细胞的获取方法，包括以下步骤：1)配制海藻酸钠和D‑甘露醇混合溶液，过滤除菌；2)提取人真皮成纤维细胞并体外大量培养；3)经静电喷雾法得到包裹人真皮成纤维细胞的海藻酸钠微球；4)对海藻酸钠微球处理得到APA微球；5)APA微球体外培养将人真皮成纤维细胞诱导为人毛乳头样细胞。本发明采用海藻酸钠微球包裹人真皮成纤维细胞以模拟DP细胞在人体内聚集生长的特性，通过该方法使人真皮成纤维细胞向人毛乳头细胞方向发生转分化，得到大量具有诱导毛发生成能力的人毛乳头样细胞，有效解决了人毛乳头细胞难获取并且在体外培养易丢失生物活性的问题。

技术领域

本发明属于生物材料和再生医学领域，具体涉及一种人工毛乳头样细胞的获取方法。

背景技术

毛发作为皮肤的附属器官，在控制体温和保护皮肤等方面起着重要作用。疾病和药物治疗都会导致脱发，虽然脱发不会直接威胁人类的生命，但会使患者的心理和生活质量造成一定的困扰。目前，最常见的脱发原因是雄激素源性脱发，这类患者的毛囊干细胞早期并未受到伤害，而真皮毛乳头(dermal papilla，DP)细胞的信号传导却受到了干扰，从而无法维持毛发的生长。因此，DP细胞是治疗脱发的关键性靶标点。

目前对于脱发的治疗目前主要采用药物治疗和自体毛囊移植两种方法。市场上获得治疗脱发的药物虽然具有一定的效果，但是并不能促进新的毛囊的形成，故治标不治本。自体毛囊移植往往需要大量具有毛囊再生功能的DP细胞。一方面在一些严重的脱发患者中供移植的自体人头皮毛乳头细胞来源十分有限，另一方面这些移植的细胞不能扩增，故临床上从患者处获得足够量的进行手术移植的DP细胞的可行性不大，亟需找到快速获取大量具有毛囊再生功能的DP细胞的方法。毛囊的形成源于表皮和真皮的相互作用，其中，DP细胞在诱导毛囊再生和毛发周期中具有决定性的作用。DP细胞在体外培养时，其诱导毛发再生的能力会迅速丢失，所以如何在体外培养过程中获得大量DP细胞的同时维持其诱导毛发再生的能力已经成为目前研发的热点和难点。

研究发现成纤维细胞具有多向分化潜能，在特定条件下能够向骨、软骨、心肌、肝、神经以及胰岛等多胚层组织器官分化。DP细胞作为一群特化的真皮成纤维细胞，与其它真皮成纤维细胞相比具有很多独特的性质，如高度的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及在体外有聚集生长的趋势等。不同于DP细胞较难获取并且在体内易丢失生物活性的特点，成纤维细胞广泛地存在于皮肤组织中，并且其提取及培养技术都较为成熟，操作较为简单，在体外培养条件下容易保持其生理学特征。在传统培养条件下成纤维细胞可以快速增殖，如果能有效地诱导成纤维细胞向DP细胞方向分化，则有希望获得大量DP样细胞，为自体毛囊移植奠定细胞基础。

与普通的平板培养相比，三维环境更能模拟体内微环境，而利用生物材料可以在体外为细胞提供特定的三维环境。大量研究报告表明细胞在静电喷雾法制备的海藻酸钠水凝胶三维体系中能够自由迁移，并且能够维持较高的活性水平。

专利200410091871.5公开了一种人工毛乳头替代结构及其制作方法，在毛乳头细胞外面包裹海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠三层结构膜的中空微囊，微囊的直径为200-650μm，微囊的壁厚为2-12μm。该人工毛乳头替代结构的功能与毛乳头十分相似，具有诱导毛囊再生及维持毛发生长的功能，而且该结构可以再体外由人工制作得到。但是，能够在临床上用于提取的毛乳头细胞相对来源少，提取能够快速增长的毛乳头细胞相对困难，在提取过程中需要加入多种生长因子的刺激，而且更重要的是体外培养过程中诱导毛发生成的能力迅速丢失。以上这些特点极大地限制了以上专利方法的临床应用。

为了解决DP细胞来源的问题，研究者们尝试诱导具有干性的细胞，如胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)，诱导多功能干细胞(inducedpluripotent stem cell,iPSC)，间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)等向毛乳头方向分化，使其成为具有促进毛囊生成能力的DP样细胞。但是过程繁琐复杂，诱导成本高，获取DP样细胞的效率低，而且干细胞在体内存在形成畸胎瘤的风险。